Summary
Abbiamo sviluppato un protocollo generalizzato per dissociare una grande quantità di singole cellule di alta qualità dall'epitelio e dal mesenchima / tessuto connettivo delle lingue del topo embrionali e adulte.
Abstract
La dissociazione cellulare è stata una procedura essenziale per gli studi a livello di singola cellula e/o a livello di popolazione cellulare (ad esempio, sequenziamento dell'RNA a singola cellula e coltura cellulare primaria). Produrre cellule vitali e sane in grandi quantità è fondamentale e le condizioni ottimali per farlo sono dipendenti dai tessuti. Le popolazioni cellulari nell'epitelio della lingua e nel mesenchima sottostante /tessuto connettivo sono eterogenee e le strutture tissutali variano in diverse regioni e in diversi stadi di sviluppo. Abbiamo testato protocolli per isolare le cellule dall'epitelio della lingua del topo e dal mesenchima / tessuto connettivo nelle prime fasi di sviluppo [giornata embrionale 12.5 (E12.5)] e giovani adulti (8 settimane). Una separazione netta tra l'epitelio e il mesenchima/tessuto connettivo sottostante era facile da realizzare. Tuttavia, per elaborare e isolare ulteriormente le cellule, producendo cellule sane vitali in grandi quantità e un'attenta selezione del buffer di digestione enzimatica, del tempo di incubazione e della velocità e del tempo di centrifugazione sono fondamentali. L'incubazione di epitelio separato o mesenchima/tessuto connettivo sottostante nello 0,25% di tripsiderina-EDTA per 30 min a 37 °C, seguita da centrifugazione a 200 x g per 8 min ha portato a un alto rendimento delle cellule ad un alto tasso di vitalità (>90%) indipendentemente dalle fasi del mouse e dalle regioni della lingua. Inoltre, abbiamo scoperto che sia le cellule del tessuto epiteliale dissociato che mesenchimale /connettivo dalle lingue embrionali e adulte potrebbero sopravvivere nel mezzo a base di coltura cellulare per almeno 3 ore senza una significativa diminuzione della vitalità cellulare. I protocolli saranno utili per studi che richiedono la preparazione di cellule isolate dalle lingue del topo nelle prime fasi di sviluppo (E12.5) e giovani adulti (8 settimane) che richiedono la dissociazione cellulare da diversi compartimenti tissutali.
Introduction
La lingua dei mammiferi è un organo complesso critico per il gusto, il parlare e la lavorazione degli alimenti. È composto da più tipi di tessuti altamente organizzati compartimentati da mesenchima / tessuto connettivo e coperti da un foglio epiteliale stratificato contenente papille gustative e papille gustative. Le popolazioni cellulari sia nell'epitelio della lingua che nel mesenchima/tessuto connettivo sono eterogenee. Per comprendere meglio le funzioni e la distribuzione di un particolare tipo di cellule nella lingua, sono necessari studi utilizzando cellule dissociate. Ad esempio, il sequenziamento dell'RNA a singola cella è un metodo potente e ad alta produttività per la profilazione trascrittamica nelle singole cellule, progettato per comprendere il trascrittame del tessuto complesso con una risoluzione a singola cellula1,2,3,4. La coltura cellulare primaria si è dimostrata uno strumento utile per studiare la funzione e la differenziazione delle cellule staminali/progenitrici per le papillegustative 5,6. Questi studi richiedono una grande quantità di popolazioni cellulari isolate di alta qualità (ad esempio, numero totale sufficiente di cellule con concentrazione adeguata e alta vitalità).
Pertanto, è necessario isolare le cellule da diverse regioni dei tessuti linguali e in diverse fasi di sviluppo. Attualmente, non esiste un protocollo dettagliato disponibile per la dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima /tessuto connettivo sottostante. Qui, reportiamo un metodo di dissociazione cellulare ottimizzato per preparare le cellule per esperimenti che richiedono un'alta qualità di cellule vive come per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e le colture primarie di cellule staminali. Abbiamo scoperto che la selezione del tampone di digestione enzimatica, la pipettazione delicata, la selezione del mezzo di resuspensione e il tempo e la velocità di centrifugazione ottimali sono cruciali per generare queste grandi quantità di cellule di alta qualità.
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Protocol
L'uso degli animali (topi C57BL/6 durante tutto lo studio) è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Georgia ed è stato in conformità con le Linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali per la ricerca.
1. Uso animale
NOTA: I topi sono stati allevati e mantenuti nella struttura animale del dipartimento di scienze animali e lattiero-casearie dell'Università della Georgia a 22 °C sotto i cicli giorno/notte di 12 ore.
- Designare mezzogiorno del giorno di rilevamento della spina vaginale nei topi come giorno embrionale (E) 0,5. Utilizzare embrioni a E12.5 e topi postnatali a 8 settimane di età per i seguenti esperimenti.
2. Preparazione prima dell'esperimento
NOTA: Gli strumenti necessari per questo protocollo sono elencati nella tabella dei materiali.
- Strumenti autoclave prima dell'esperimento. Sterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore di perline durante l'esperimento.
- Pulire l'area chirurgica, il microscopio sezionato e l'armadio per la biosicurezza utilizzando il 70% di salviette di etanolo. Accendere la luce UV dell'armadio di biosicurezza e tenerla in funzione per 20 minuti prima della procedura sperimentale.
- Preparare una miscela enzimatica di 1:1 dispasi (5,0 mg/ml) e collagenasi (2,0 mg/ml) ad una concentrazione finale rispettivamente di 2,5 e 1,0 mg/ml e filtrare la soluzione utilizzando il filtro siringa da 0,22 μm7.
- Preparare 1 mL di miscela enzimatica per una lingua adulta o 0,5 mL per una regione specifica della lingua (ad esempio, lingua posteriore o anteriore).
- Preparare 2 mL di miscela enzimatica per le lingue embrionali.
- Effettuare 10 ml di BSA al 2,5% in 0,1 M PBS e filtrare la soluzione utilizzando una siringa da 1 ml e un filtro siringa da 0,22 μm.
- Fare 500 μL di FBS al 5% in DMEM/F12.
- Effettuare 3 ml di DMEM/F12 contenenti 10% FBS e 1% BSA e filtrare la soluzione utilizzando una siringa da 1 ml e un filtro siringa da 0,22 μm.
3. Separazione dell'epitelio della lingua dal mesenchima/tessuto connettivo sottostante
- Separazione dell'epitelio dal mesenchima di una lingua del topo E12.5
- Eutanasia topi femmine gravidi a tempo che trasportano embrioni E12.5 posizionandolo in una camera di CO2 seguita da lussazione cervicale.
NOTA: Gli embrioni di topo a E12.5 vengono raccolti dopo le 12:00 (pomeriggio) del 12 ° giorno dopo il rilevamento della spina vaginale nei topi femmine in gravidanza. - Trasferire i topi nell'area chirurgica. Bagnare l'addome del topo usando il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entra nel sito operativo.
- Aprire l'addome usando forbici sezionanti per esporre le corna uterine che trasportano embrioni. Sezionare le corna uterine utilizzando forbici sezionanti e trasferirlo a 15 mL di soluzione di Tirolo fresco in un piatto da coltura da 100 mm.
- Sezionare gli embrioni (Figura 1A1) dalle corna uterina sotto un microscopio sezionante utilizzando mini-forbici e forcep fini.
- Aprire accuratamente la cavità orale ampia utilizzando forcep fini e sezionare la lingua dalla mattiera utilizzando mini-forbici (Figura 1A2).
- Lavare le lingue utilizzando 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto da coltura da 100 mm.
- Trasferire i tessuti a 2 mL di miscela enzimatica di dispasi (2,5 mg/mL) e collagenasi (1,0 mg/mL) in un piatto di coltura da 35 mm con spatola e forceps fini in un armadio di biosicurezza. Incubare per 20 min a 37 °C.
- Trasferire le lingue a 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 mm e rimuovere delicatamente il mesenchima dall'epitelio dal lato ventrale utilizzando forcep fini.
NOTA: I fogli epiteliali possono essere separati senza forza meccanica durante l'incubazione. - Lavare due volte l'epitelia separata e il mesenchima in 15 mL di soluzione di Tyrode sterile fresco in un piatto da coltura da 100 mm.
NOTA: Le attività della dispasi e della collagenasi saranno inibite dall'EDTA nella procedura di dissociazione cellulare (fase 4.1).
- Eutanasia topi femmine gravidi a tempo che trasportano embrioni E12.5 posizionandolo in una camera di CO2 seguita da lussazione cervicale.
- Separazione dell'epitelio della lingua dal tessuto connettivo sottostante dei topi adulti
- Eutanasia il topo a 8 settimane di età posizionandolo in una camera di CO2. Confermare che il mouse è eutanasiato senza respiri e risposta forepaw-pinch.
- Trasferire i topi nell'area chirurgica. Bagnare la testa del topo usando il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entra nella cavità orale.
- Tagliare gli angoli della bocca lungo la guancia usando forbici sezionanti per aprire la cavità orale. Sezionare la lingua con mattiglia(Figura 1B1) e posizionare in un piatto di plastica con uno strato di involucro di plastica.
- Utilizzando le forcep chirurgiche per tenere la lingua al microscopio sezionato, iniettare la miscela enzimatica di dispasi (2,5 mg/mL) e collagenasi (1,0 mg/mL) nello spazio sub-epiteliale della lingua attraverso il tagliente(Figura 1B1, frecce) della lingua posteriore.
- Iniettare 1 mL di miscela enzimatica uniformemente a tutta la lingua per la raccolta dei tessuti sia dalla lingua anteriore che posteriore.
- Iniettare 0,5 mL di miscela enzimatica localmente alla lingua anteriore per la raccolta dei tessuti dalla punta della lingua o alla lingua posteriore per la raccolta circonvallata dei tessuti di papilla.
NOTA: La lingua si gonfierà man mano che l'enzima si accumula(Figura 1B2). L'iniezione delicata dell'enzima può impedire che la pressione danneggi l'epitelio e mantenere il maggior enzima possibile nella lingua.
- Avvolgere la lingua con un involucro di plastica e incubare la lingua per 30 minuti a 37 °C.
- Utilizzare mini-forbici per sezionare la punta della lingua e / o la papilla circonvallata e utilizzare spatole e forcelle fini per trasferire i tessuti a 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 mm.
- Separare l'epitelio dal tessuto connettivo sottostante nello spazio sub-epiteliale digerito dall'enzima usando mini-forbici. Tagliare i tessuti a una dimensione adeguata in base al requisito degli esperimenti a valle.
- Lavare l'epitelio separato e il tessuto connettivo sottostante due volte in 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 mm.
NOTA: Le attività della dispasi e della collagenasi saranno inibite dall'EDTA nella procedura di dissociazione cellulare (fase 4.1).
4. Dissociazione cellulare
NOTA: Il protocollo di dissociazione cellulare qui descritto può essere applicato all'epitelio della lingua e al mesenchima / tessuto connettivo sia nei topi embrionali E12.5 che in quello di 8 settimane. Per ridurre la perdita di cellule durante l'agitazione e il trasferimento delle sospensioni cellulari, utilizzare punte commerciali a bassa ritenzione o punte di pipetta pre-rivestite con BSA al 2,5% in 0,1 M PBS a pH 7,48.
- Trasferire i tessuti utilizzando spatola e forcelle fini a 3 mL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA in un nuovo piatto da coltura da 35 mm per 30 min a 37 °C. Agitare delicatamente i tessuti ogni 5 minuti con punte di pipetta da 1 mL.
NOTA: Non tagliare la punta della pipetta, poiché il tagliente può danneggiare fisicamente le cellule dissociate. - Aggiungere 500 μL di FBS al 5% in DMEM/F12 per interrompere la reazione e trasferire il mezzo in un tubo di centrifuga a bassa legatura da 5 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 8 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante.
- Sospendere delicatamente le cellule in 3 mL di DMEM/F12 contenenti 10% FBS e 1% BSA utilizzando punte di pipetta da 1 mL e filtrare le cellule utilizzando un colino cellulare da 70 μm, seguito da un colino cellulare da 35 μm.
- Sospensione della cella di centrifuga a 200 x g per 8 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la maggior parte del mezzo e lasciare 50-300 μL come volume finale per sospendere di nuovo le celle.
NOTA: Regolare la concentrazione delle cellule in base alle esigenze degli esperimenti a valle modificando il volume finale della sospensione a singola cella.
5. Test di conteggio cellulare e vitalità con emocitometro
NOTA: Per migliorare la precisione di misura, sono consigliate 3 repliche tecniche per ogni campione.
- Mescolare delicatamente 5-10 μL della sospensione a singola cella con un volume uguale di blu Trypan e aggiungere all'emocitometro.
NOTA: Pulire accuratamente l'emocitometro utilizzando il 70% di etanolo prima dell'uso. Le particelle di polvere sull'emocitometro saranno macchiate di blu scuro e influenzeranno l'accuratezza del test di vitalità. Controllare l'emocitometro al microscopio. - Contare il numero totale di celle, il numero di celle vive (bianche) e il numero di celle morte (blu scuro) macchiate rispettivamente da Trypan blue (Figura 2, frecce) in 4 quadrati con 16 griglie (Figura 2) utilizzando il microscopio invertito con sistema di imaging.
- Calcolare la concentrazione cellulare:
Concentrazione cellulare =
- Calcola la fattibilità:
Vitalità =
- Calcola la fattibilità:
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Representative Results
Separazione dell'epitelio della lingua dal mesenchima/tessuto connettivo sottostante
Nella lingua embrionale del topo, uno spazio nello spazio sub-epiteliale è visibile dopo una corretta digestione enzimatica. I fogli epiteliali di alcune lingue sono separati senza forza meccanica durante l'incubazione.
Nella lingua adulta del topo, un'iniezione enzimatica di successo è indicata dal gonfiore nelle aree iniettate (Figura 1B2), che suggerisce che l'enzima può essere tenuto dalla lingua. L'insufficiente inserimento di enzimi e/o aghi profondi nel mesenchima e/o penetrazione epiteliale della lingua mediante ago indurrà un gonfiore parziale dell'area di iniezione o nessun gonfiore. Dopo la digestione enzimatica, i tessuti connettivi sottostanti con una corretta digestione enzimatica diventano sciolti e appiccicosi. Uno spazio nel sottoeteliale è visibile quando si solleva delicatamente il bordo del foglio epiteliale.
Effetto della dissociazione cellulare sul numero totale di cellule e sulla vitalità
Con il passaggio 4, le lingue E12.5, i fogli epiteliali e sottili strati di mesenchima immediatamente sotto l'epitelio delle lingue sono stati raggruppati, rispettivamente. Il conteggio manuale delle cellule con un emocitometro(Figura 2)ha dimostrato che il protocollo ha prodotto 63.917 cellule in totale con una vitalità del 95,2% dai fogli epiteliali (circa 0,3 mm2 di dimensioni per lingua) )(Figura 1A3) e 294.333 cellule in totale con una vitalità del 96,3% dal mesenchima (circa 0,3 mm2 di dimensioni per lingua)(figura 1A4).
Usando 10 lingue adulte a 8 settimane di età, i pezzi dei fogli epiteliali della punta della lingua (dove le papille gustative sono densamente distribuite), i fogli epiteliali di papille circumvallate e sottili strati di tessuto connettivo immediatamente sotto l'epitelio delle papille circumvallate sono stati raggruppati, rispettivamente. Un conteggio manuale delle cellule utilizzando l'emocitometro (Figura 2) ha dimostrato che il protocollo ha prodotto 187.333 cellule in totale con una vitalità del 95,4% da fogli epiteliali di punta della lingua (circa 0,075 mm2 di dimensione per lingua)(figura 1B3),544.000 cellule in totale con una vitalità del 96,3% da fogli epiteliali di papille circumvallate (circa 0,1 mm2 di dimensione per lingua)(figura 1B5) e 150.500 cellule in totale con una vitalità del 93% dai tessuti connettivi (circa 0,1 mm2 di dimensione per lingua)(figura 1B6).
Figura 1. Preparazione tissutale per la dissociazione cellulare. A) Immagini rappresentative di un embrione intero E12.5 (A1),vista dorsale della lingua sezionata (A2)e fogli epiteliali (A3)e mesenchima (A4)separati dalle lingue. B)Immagini rappresentative di una lingua adulta prima (B1)e dopo iniezione enzimatica (B2). Vista dorsale di un foglio epiteliale (B3) e mesenchima (B4) della punta della lingua, e di un foglio epiteliale (B5)e del tessuto connettivo sottostante (B6)di papilla circonvallata. Barre di scala: 1 mm in A1, A3, A4, B1, B2; 200 μm in A2; 100 μm in B3, B4, B5 e B6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Immagini rappresentative di cellule isolate visualizzate nell'emocitometro. A)Cellule isolate da fogli epiteliali (A1)e mesenchima (A2)di embrioni a E12.5. B)Cellule isolate dai fogli epiteliali (B1)e dai nuclei del tessuto connettivo sottostante (B2)di papille circumvallate a 8 settimane di età. Le linee tratteggiate circondano le griglie amplificate nell'angolo in alto a destra. Le frecce indicano le celle morte macchiate dal blu di Trypan. Barre di scala: 100 μm per B1,B2, B3e B4; 25 μm per immagini ad alta potenza nell'angolo in alto a destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ad oggi, non è stato disponibile un protocollo dettagliato per la dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima /tessuto connettivo sottostante. Questo protocollo di dissociazione cellulare corrente fornisce una procedura riproducibile per generare una sospensione a singola cella con un'elevata vitalità cellulare (>90%) dai tessuti della lingua del topo, compresi i fogli epiteliali e i tessuti mesenchima/connettivi sia allo stadio embrionale che postnatale, anche se le cellule isolate di E12,5 e topi adulti sono di dimensioni diverse. Ad esempio, le cellule isolate dall'epitelio e dal mesenchima delle lingue del topo E12.5 sono coerenti e piccole in contrasto con una grande variabilità (da piccola a grande) di cellule dalla lingua del topo di 8 settimane. Con il vantaggio dell'elevata redditività (>90%) delle cellule isolate, la sospensione a singola cellula resa può facilitare gli esperimenti a valle che richiedono un'alta qualità di cellule vitali (ad esempio, sequenziamento dell'RNA a singola cellula e colture cellulari primarie).
Per garantire l'elevata vitalità delle cellule, occorre prestare particolare attenzione a diversi fattori importanti. Un tempo di digestione adeguato con miscela di dispasi e collagenasi può separare efficacemente l'epitelio dal mesenchima / tessuto connettivo sottostante preservando le cellule vitali. Si raccomanda un'incubazione di 20 minuti per la lingua embrionale e un'incubazione di 30 minuti per la lingua adulta. Anche se i fogli epiteliali possono essere facilmente sbucciati dopo la digestione enzimatica, si consiglia di tagliare con le forbici per la separazione, che può preservare la popolazione di cellule staminali nell'area basale dell'epiteliodella lingua 9. La scelta dello 0,25% di tripside-EDTA rispetto alla sola tripside è altamente raccomandata per dissociare le cellule in quanto lo 0,25% di tripside-EDTA può dissociare le cellule in modo più efficiente e mantenere le cellule in separazione rispetto alla sola tripside. L'uso di un mezzo basato sulla coltura cellulare (DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di BSA) per sospendere le cellule dopo la digestione enzimatica è fondamentale e contribuisce alla maggiore vitalità delle cellule isolate rispetto al mezzo di sospensione cellulare (ad esempio, 1% di BSA in 0,1 M PBS). Inoltre, le cellule isolate hanno un tasso di sopravvivenza più elevato in questo mezzo nel tempo: almeno 3 ore senza una significativa diminuzione della vitalità cellulare. La tecnica di pipettazione è un altro fattore critico per garantire un'elevata vitalità cellulare. Aspirare delicatamente le cellule supernatanti e di nuova sospensione utilizzando una pipetta può ridurre la perdita di cellule extra e i danni fisici alle cellule.
La concentrazione di cellule isolate in una singola sospensione cellulare è un'altra considerazione importante per gli esperimenti a valle. In un dato numero di cella totale, la concentrazione cellulare può essere regolata in base al volume finale della soluzione rimorsiata. Per la prima prova in cui il numero totale di celle è sconosciuto, la resopensione delle cellule isolate dovrebbe iniziare a un volume basso. Quindi, le cellule isolate possono essere diluite in base ai requisiti degli esperimenti a valle. Da notare che nella nostra soluzione a base media di coltura, gli aggregati cellulari sono stati trovati quando la concentrazione era superiore a 4000 cellule / μL (circa 200 cellule per quadrato nell'emocitometro). Le concentrazioni ottimali vanno da 500 a 2500 cellule/μL.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dai National Institutes of Health, dal numero di sovvenzione R01DC012308 e dall'R21DC018089 all'HXL. Grazie a Brett Marshall (Università della Georgia, Atene, GA) ed Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) per l'assistenza tecnica e la consultazione sulla dissociazione cellulare; a Francisca Gibson Burnley (Università della Georgia, Atene, GA) per l'editing in inglese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
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