12.5日目および8週齢マウスの舌上皮・間分性/結合組織からの細胞解離
Summary
我々は、胚および成体マウス舌の上皮および間線質/結合組織から大量の高品質単一細胞を解離するための一般化されたプロトコルを開発した。
Abstract
細胞解離は、個々の細胞レベルおよび/または細胞集団レベル(例えば、単一細胞RNAシーケンシングおよび一次細胞培養)での研究に不可欠な手順であった。大量に生存可能で健康な細胞を産出することは重要であり、そのために最適な条件は組織依存である。舌上皮および基礎となる間質/結合組織における細胞集団は異種であり、組織構造は異なる領域および異なる発達段階で異なる。我々は、初期発達[胚性12.5日目(E12.5)]および若年成人(8週間)段階でマウス舌上皮および間葉/結合組織から細胞を単離するためのプロトコルを試験した。上皮と下層の間質/結合組織との間のきれいな分離は容易に達成した。しかし、さらに細胞を処理して単離するには、生存可能な健康細胞を大量に生成し、酵素消化バッファー、インキュベーション時間、遠心分離の速度と時間を慎重に選択することが重要です。分離した上皮または基になる間葉系/結合組織を37°Cで30分間0.25%トリプシン-EDTAでインキュベーションし、続いて200xgで8分間遠心し、高い生存率(>90%)で細胞の高収率をもたらしたマウスのステージと舌の領域に関係なく。さらに、胚性および成体の舌からの解離された上皮および間葉/結合組織細胞の両方が、細胞生存率の有意な減少なしに少なくとも3時間細胞培養ベースの培地で生存できることを発見した。このプロトコルは、初期発達(E12.5)および若年成人(8週間)段階で異なる組織コンパートメントからの細胞解離を必要とするマウス舌からの単離細胞の調製を必要とする研究に有用である。
Introduction
哺乳類の舌は、味、話す、および食品処理に不可欠な複雑な器官である。それは間葉/結合組織によって区分され、味乳頭および味覚芽を含む階層化された上皮シートによって覆われる高度に組織化された組織の複数のタイプで構成される。舌上皮と間質/結合組織の両方の細胞集団は不均一である。舌の特定のタイプの細胞の機能と分布をよりよく理解するためには、解き分け細胞を用いた研究が必要である。例えば、単一細胞RNAシーケンシングは、個々の細胞における転写プロファイリングのための強力かつハイスループットな方法であり、単一細胞分解能1、2、3、4における複雑な組織の転写物を理解するように設計されている。一次細胞培養は、味覚芽5,6の幹細胞/前駆細胞の機能と分化を研究するのに有用なツールであることが証明されている。これらの研究は、大量の高品質の単離された細胞集団(例えば、適切な濃度および高い生存率を有する十分な総細胞数)を必要とする。
したがって、言語組織の異なる領域から、異なる発達段階で細胞を分離する必要があります。現在、舌上皮および基礎となる間質/結合組織からの細胞解離に利用できる詳細なプロトコルはない。ここでは、単一細胞RNAシーケンシングや一次幹細胞培養など、高い品質の生細胞を必要とする実験のために細胞を調製するための最適化された細胞解離方法を報告する。我々は、酵素消化バッファー、穏やかなピペット、再懸濁培地の選択、および最適な遠心分離時間と速度の選択は、これらの大量の高品質の細胞を生成するために重要であることを発見しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在までに、舌上皮および基礎となる間質/結合組織からの細胞解離に関する詳細なプロトコルは利用できていない。この現在の細胞解離プロトコルは、高い細胞生存率(>90%)を有する単一細胞懸濁液を生成する再現可能な手順を提供するE12.5と成体マウスからの単離された細胞が異なるにもかかわらず、胚および出生後の両方の段階で上皮シートおよび間葉/結合組織を含むマウスの舌組織から…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所、助成番号R01DC012308、R21DC018089によってHXLに支援されました。ブレット・マーシャル(ジョージア大学、アテネ、GA)とエゴン・ランヒニ(10X GENOMICS、プレザントン、CA)に感謝し、細胞解離に関する技術支援と相談を行いました。フランシスカ・ギブソン・バーンリー(ジョージア大学、アテネ、ジョージア州)に英語編集。
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
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