Summary

Dissociação celular do Epitélio da Língua e Mesenquime/Tecido Conjuntivo de Ratos Embrionários 12,5 e 8 Semanas

Published: January 21, 2021
doi:

Summary

Desenvolvemos um protocolo generalizado para dissociar uma grande quantidade de células únicas de alta qualidade a partir do epitélio e mesenquime/tecido conjuntivo de línguas de camundongos embrionários e adultos.

Abstract

A dissociação celular tem sido um procedimento essencial para estudos no nível de células individuais e/ou a nível de população celular (por exemplo, sequenciamento de RNA de células únicas e cultura celular primária). Produzir células viáveis e saudáveis em grandes quantidades é crítico, e as condições ideais para fazê-lo são dependentes de tecidos. As populações celulares no epitélio da língua e no tecido mesenquime/conjuntivo subjacente são heterogêneas e as estruturas teciduais variam em diferentes regiões e em diferentes estágios de desenvolvimento. Testamos protocolos para isolar células do epitélio da língua do rato e do tecido mesenquime/conjuntivo nas fases de desenvolvimento inicial [dia embrionário 12.5 (E12.5)] e jovens adultos (8 semanas). Uma separação limpa entre o epitélio e o tecido mesenquime/conjuntivo subjacente foi fácil de realizar. No entanto, para processar e isolar ainda mais as células, produzir células saudáveis viáveis em grandes quantidades, e seleção cuidadosa de tampão de digestão enzimática, tempo de incubação e velocidade e tempo de centrifugação são críticos. Incubação de epitélio separado ou tecido conjuntivo/mesenquime subjacente em 0,25% Trippsin-EDTA por 30 min a 37 °C, seguido por centrifugação a 200 x g por 8 min resultou em um alto rendimento de células a uma alta taxa de viabilidade (>90%) independentemente dos estágios do rato e regiões da língua. Além disso, descobrimos que tanto células epiteliais dissociadas quanto mesenquimais/conjuntivas de línguas embrionárias e adultas poderiam sobreviver no meio baseado na cultura celular por pelo menos 3 h sem uma diminuição significativa da viabilidade celular. Os protocolos serão úteis para estudos que requerem a preparação de células isoladas de línguas de camundongos em estágios de desenvolvimento precoce (E12,5) e jovens adultos (8 semanas) que requerem dissociação celular de diferentes compartimentos teciduais.

Introduction

A língua dos mamíferos é um órgão complexo crítico para o sabor, fala e processamento de alimentos. É composta por vários tipos de tecidos altamente organizados compartimentados por mesenchyme/tecido conjuntivo e cobertos por uma folha epitelial estratificada contendo papilas gustativas e papilas gustativas. Populações celulares em epitélio de língua e tecido mesenquime/conjuntivo são heterogêneas. Para entender melhor as funções e distribuição de um determinado tipo de células na língua, são necessários estudos com células dissociadas. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de célula única é um método poderoso e de alto rendimento para o perfil transcriômico em células individuais, que é projetado para entender o transcriptome de tecido complexo em uma resolução unicelular1,2,3,4. A cultura celular primária tem sido comprovadamente uma ferramenta útil para estudar a função e diferenciação de células-tronco/progenitoras para as papilas gustativas5,6. Esses estudos requerem uma grande quantidade de populações de células isoladas de alta qualidade (por exemplo, número celular total suficiente com concentração adequada e alta viabilidade).

Assim, é necessário isolar células de diferentes regiões dos tecidos linguais e em diferentes estágios de desenvolvimento. Atualmente, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e tecido mesenquime/conjuntivo subjacente. Aqui, relatamos um método otimizado de dissociação celular para preparar células para experimentos que requerem uma alta qualidade de células vivas, como para sequenciamento de RNA de células únicas e culturas primárias de células-tronco. Descobrimos que a seleção de tampão de digestão enzimática, pipetação suave, seleção de meio de resuspensão e tempo e velocidade de centrifugação ideais são cruciais para gerar essas grandes quantidades de células de alta qualidade.

Protocol

O uso de animais (C57BL/6 camundongos ao longo do estudo) foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia e esteve de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde para cuidados e uso de animais para pesquisa. 1. Uso de animais NOTA: Os camundongos foram criados e mantidos na instalação animal do departamento de Ciência Animal e Leite na Universidade da Geórgia a 22 °C sob ciclos de dia/noite de 12h.</…

Representative Results

Separação do epitélio da língua do tecido mesenquime/conjuntivo subjacenteNa língua do rato embrionário, uma lacuna no espaço sub-epitelial é visível após a digestão adequada da enzima. Folhas epiteliais de algumas línguas são separadas sem força mecânica durante a incubação. Na língua do rato adulto, uma injeção de enzima bem sucedida é indicada pelo inchaço nas áreas injetadas (Figura 1B2), …

Discussion

Até o momento, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e do tecido conjuntivo/mesenquime subjacente. Este protocolo de dissociação celular atual fornece um procedimento reprodutível para gerar uma única suspensão celular com uma alta viabilidade celular (>90%) de tecidos de língua de camundongos, incluindo folhas epiteliais e tecidos mesenquime/conjuntivos em estágios embrionários e pós-natais, embora células isoladas de E12,5 e camundongos adulto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, número de subvenção R01DC012308 e R21DC018089 para HXL. Agradecemos a Brett Marshall (Universidade da Geórgia, Atenas, GA) e Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) por assistência técnica e consulta sobre a dissociação celular; para Francisca Gibson Burnley (Universidade da Geórgia, Atenas, GA) para edição em inglês.

Materials

bovine serum albumin (BSA) Gold Biotechnology A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J) The Jackson Laboratory 000664
collagenase (Collagenase A) Sigma-Aldrich 10103586001
culture dish (35 mm in diameter) Genesee Scientific 32-103G
culture dish (100 mm in diameter) Genesee Scientific 32-107G
dispase (Dispase II) Sigma-Aldrich 04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors) Find Science Tool 91460-11
DMEM/F12 Gibco 11320033
fetal bovine serum (FBS) Hyclone C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps) Find Science Tool 11293-00
hemocytometer Hausser Scientific 3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) Life Technologies AMEX1000
low retention pipette tips METTLER TOLEDO 17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors) Fine Science Tool 15800-01
plastic warp VWR 46610-056
spatula (Moria Spoon) Fine Science Tool 10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) Fine Science Tool 11223-20
Trypan blue Gibco 15250061
Tyrode’s solution Sigma-Aldrich T2145-10L made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA Gibco 25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) Hoefer 33946 made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter Genesee Scientific 25-243
70% ethanol Koptec 233919 made from 100% ethanol
1-mL syringe BD 8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube Eppendorf 30122348
30-G needle BD 9193532
35-μm cell strainer Falcon 64750
70-μm cell strainer Falcon 64752

References

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Cite This Article
Yu, W., Ishan, M., Wang, Z., Liu, H. Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice. J. Vis. Exp. (167), e62163, doi:10.3791/62163 (2021).

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