배아의 날 12.5 및 8 주 된 마우스의 혀 상피 및 메센키메 / 결합 조직에서 세포 해리
Summary
우리는 배아와 성인 마우스 혀의 상피 및 중간/ 결합 조직에서 대량의 고품질 단일 세포를 해리시키는 일반화 프로토콜을 개발했습니다.
Abstract
세포 해리는 개별 세포 수준 및/또는 세포 집단 수준에서의 연구를 위한 필수적인 절차였습니다(예를 들어, 단세포 RNA 염기서열 분석 및 1차 세포 배양). 가능한, 다량에 있는 건강한 세포를 산출하는 것은 중요합니다, 이렇게 하기 위하여 최적 조건은 조직에 달려 있습니다. 혀 상피 및 기본 중간 엽/결합 조직에 있는 세포 인구는 이질적이고 조직 구조물은 다른 지구및 다른 발달 단계에서 변화합니다. 우리는 초기 발달 [배아 일 12.5 (E12.5)] 및 젊은 성인 (8 주) 단계에서 마우스 혀 상피 및 중간/ 결합 조직에서 세포를 격리하기위한 프로토콜을 테스트했습니다. 상피와 근본적인 메센키메/결합 조직 사이의 깨끗한 분리는 쉽게 달성할 수 있었습니다. 그러나 세포를 추가처리 및 분리하고, 가능한 건강한 세포를 대량으로 산출하고, 효소 소화 완충제, 인큐베이션 시간 및 원심 분리 속도와 시간을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 분리된 상피 또는 기본 메센키메/결합 조직의 배양은 37°C에서 30분 동안 트립신-EDTA0으로, 8분 동안 200 x g에서 원심분리로 이어져 높은 생존율(>90%)으로 세포의 높은 수율을 초래했습니다(>90%) 마우스 단계와 혀 부위에 관계없이. 더욱이, 우리는 배아와 성인 방언에서 해리된 상피 및 중간엽/결합 조직 세포 둘 다 세포 생존성의 유의한 감소 없이 적어도 3 시간 동안 세포 배양 기지를 둔 매체에서 살아남을 수 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 프로토콜은 초기 발달 (E12.5) 및 다른 조직 구획에서 세포 해리를 요구하는 젊은 성인 (8 주) 단계에서 마우스 혀에서 격리 된 세포의 준비를 필요로하는 연구에 유용 할 것이다.
Introduction
포유류 혀는 맛, 말하기 및 식품 가공에 중요한 복잡한 기관입니다. 그것은 메센키메 / 결합 조직에 의해 구획및 맛 유두와 미각을 포함하는 계층화 상피 시트에 의해 덮여 고도로 조직 된 조직의 여러 유형으로 구성되어 있습니다. 혀 상피와 중간엽/결합 조직 모두에서 세포 인구는 이질적이다. 혀에 있는 세포의 특정 모형의 기능 그리고 분포를 더 잘 이해하기 위하여는, 해리된 세포를 이용한 연구 결과가 필요합니다. 예를 들어, 단세포 RNA 시퀀싱은 개별 세포에서 전사 프로파일링을 위한 강력하고 높은 처리량 방법이며, 이는 단일 세포 해상도1,2,3,4에서복잡한 조직의 전사를 이해하도록 설계된다. 1차 세포 배양은미각5,6에대한 줄기/전구 세포의 기능 및 분화를 연구하는 유용한 도구로 입증되었다. 이러한 연구는 고품질 의 격리 된 세포 집단의 대량을 필요로 (예를 들어, 적절한 농도와 높은 생존력을 가진 충분한 총 세포 수).
따라서, 언어 조직의 다른 영역과 다른 발달 단계에서 세포를 분리 할 필요가있다. 현재, 혀 상피 및 기본 중간 엽/결합 조직에서 세포 해리에 사용할 수 있는 상세한 프로토콜이 없습니다. 여기서, 우리는 단세포 RNA 염기서열 분석 및 1차 줄기 세포 배양과 같은 살아있는 세포의 고품질을 요구하는 실험을 위해 세포를 준비하는 최적화된 세포 해리 방법을 보고합니다. 우리는 효소 소화 완충제, 부드러운 파이펫팅, 재서스펜션 배지 선택, 최적의 원심분리 시간 및 속도의 선택이 이러한 대량의 고품질 셀을 생성하는 데 중요하다는 것을 발견했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재까지, 혀 상피 및 기본 중간 엽/결합 조직에서 세포 해리에 사용할 수 있는 상세한 프로토콜이 없습니다. 이 현재 세포 해리 프로토콜은 높은 세포 생존가능성(>90%)을 가진 단일 세포 현탁액을 생성하는 재현 가능한 절차를 제공합니다. E12.5및 성인 마우스에서 고립된 세포가 크기가 다르더라도 태아 및 산후 단계에서 상피 시트 및 중간 엽/결합 조직을 포함한 마우스 혀 조직에서. 예를 들어, E1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다, HXL에 R01DC012308 및 R21DC018089를 부여 번호. 우리는 브렛 마샬 (조지아 대학, 아테네, GA) 및 에곤 랑히니 (10 X 게놈, 플레전턴, 캘리포니아)에게 세포 해리에 관한 기술 적 지원 및 상담에 감사드립니다. 프란시스카 깁슨 번리 (조지아 대학, 아테네, 조지아) 영어 편집에 대한.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
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