المكثفات البروتينية الناجمة عن الديميرات الكيميائية على التيلوميرات
Summary
يوضح هذا البروتوكول نظام تعتيم البروتين المستحث كيميائيا لإنشاء المكثفات على الكروماتين. يتم إظهار تشكيل الجسم النووي لسرطان الدم البروميلوسيتيكي (PML) على التيلوميرات ذات الخافضات الكيميائية. يتم رصد نمو القطيرات وانحلالها وتوطينها وتكوينها من خلال تصوير الخلايا الحية والفلورة المناعية (IF) والفلورة في التهجين الموقعي (FISH).
Abstract
والمكثفات المرتبطة بالكروماتين متورطة في العديد من العمليات النووية، ولكن الآليات الأساسية لا تزال بعيدة المنال. يصف هذا البروتوكول نظام تضفير البروتين الناجم عن المواد الكيميائية لإنشاء المكثفات على التيلوميرات. ويتكون المخمل الكيميائي من اثنين من الليغندات المرتبطة التي يمكن أن يرتبط كل منها بالبروتين: هالو ليغند إلى هالو إنزيم وتريمثوبريم (TMP) إلى إعادة الاختزال الإشريكية القولونية (eDHFR)، على التوالي. الانصهار من إنزيم هالو إلى بروتين التيلومير المراسي ديميرز إلى التيلوميرات من خلال التعادل هالو ليغاند إنزيم ملزمة. ربط TMP إلى eDHFR المجندين eDHFR تنصهر المرحلة فصل البروتينات إلى التيلوميرات ويحفز تشكيل المكثفات. لأن TMP-eDHFR التفاعل غير التكافؤ، يمكن عكس التكثيف باستخدام TMP الحرة الزائدة للتنافس مع جهاز التعتيم لربط eDHFR. ويظهر مثال على تحفيز سرطان الدم النووي (PML) تشكيل الجسم النووي على التيلوميرات وتحديد نمو المكثفات، وانحلال، والتوطين وتكوينها. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للحث على المكثفات في مواقع الجينوم الأخرى عن طريق دمج هالو إلى بروتين يرتبط مباشرة بالكروماتين المحلي أو dCas9 الذي يستهدف الموضع الجينومي مع الحمض النووي الريبي الإرشادي. من خلال تقديم الدقة الزمنية المطلوبة للتصوير الحي للخلية الواحدة مع الحفاظ على فصل المرحلة في مجموعة من الخلايا لإجراء المقايسات الكيميائية الحيوية ، فإن هذه الطريقة مناسبة للتحقيق في كل من تكوين ووظيفة المكثفات المرتبطة بالكروماتين.
Introduction
تخضع العديد من البروتينات والأحماض النووية لفصل المرحلة السائلة السائلة (LLPS) والتجمع الذاتي في المكثفات الجزيئية الحيوية لتنظيم الكيمياء الحيوية في الخلايا1،2. LLPS من البروتينات الكروماتين ملزمة يؤدي إلى تشكيل المكثفات التي ترتبط مع loci الجينوم محددة وتورطت في مختلف وظائف الكروماتين المحلية3. على سبيل المثال، LLPS من بروتين HP1 يكمن وراء تشكيل مجالات heterochromatin لتنظيم الجينوم4،5، LLPS من عوامل النسخ تشكل مراكز النسخ لتنظيم النسخ6، LLPS من mRNAs الوليدة والبروتين أمشاط متعددة الجنس يولد أجسام مكان الهستون لتنظيم نسخ ومعالجة الهستون mRNAs7. ومع ذلك ، على الرغم من اكتشاف العديد من الأمثلة على المكثفات المرتبطة بالكروماتين ، فإن الآليات الأساسية لتشكيل المكثفات وتنظيمها ووظيفتها لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. على وجه الخصوص، ليست كل المكثفات المرتبطة الكروماتين تتشكل من خلال LLPS والتقييمات الدقيقة لتشكيل المكثفات في الخلايا الحية لا تزال هناك حاجة8،9. على سبيل المثال، يظهر بروتين HP1 في الماوس أن لديها سوى قدرة ضعيفة على تشكيل قطرات السائل في الخلايا الحية وم بؤر heterochromatin تتصرف كما الكريات البوليمرالمنهارة 10. لذلك ، فإن الأدوات اللازمة لحث المكثفات دي نوفو على الكروماتين في الخلايا الحية مرغوبة ، خاصة تلك التي تسمح باستخدام التصوير الحي والمقايسات الكيميائية الحيوية لمراقبة حركية تكوين المكثفات ، والخصائص الفيزيائية والكيميائية للمكثفات الناتجة ، والعواقب الخلوية لتشكيل المكثفات.
هذا البروتوكول تقارير نظام التعتيم الكيميائية للحث على المكثفات البروتين على الكروماتين11 (الشكل 1A). ويتكون المخمل من اثنين من الليجاندات المرتبطة التفاعل البروتين: تريميثوبريم (TMP) وهالو ليغند ويمكن أن يقلل من البروتينات تنصهر في مستقبلات cognate: Escherichia القولونية ديهيدروفوليت اختزال (eDHFR) وانزيم البكتيرية الألكيلديهالوجيناز (هالو انزيم), على التوالي12. التفاعل بين هالو ليغاند وإنزيم هالو هو التكافؤ، مما يسمح أنزيم هالو لاستخدامها كمرساة عن طريق دمجه إلى بروتين الربط الكروماتين لتجنيد بروتين فصل المرحلة تنصهر إلى eDHFR إلى الكروماتين. بعد التوظيف الأولي، زيادة التركيز المحلي للمرحلة فصل البروتين يمر تركيز الحرجة اللازمة لفصل المرحلة، وبالتالي نواة المكثفات في مرساة(الشكل 1B). عن طريق دمج البروتينات الفلورية (مثل mCherry و eGFP) إلى eDHFR و Halo ، يمكن تصور نواة ونمو المكثفات في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلوري. لأن التفاعل بين eDHFR و TMP غير تساهمي، يمكن إضافة TMP الحرة الزائدة للتنافس مع جهاز التعتيم لربط eDHFR. هذا وسوف الافراج عن بروتين فصل المرحلة من مرساة وحل المكثفات المرتبطة الكروماتين.
استخدمنا هذه الأداة للحث على دي نوفو promyelocytic سرطان الدم (PML) تشكيل الجسم النووي على التيلوميرات في الخلايا السرطانية التيلوميراز السلبية التي تستخدم إطالة بديلة من التيلوميرات (ALT) مسار لصيانة التيلومير13,14. الهيئات النووية PML هي مقصورات غشاء أقل المشاركة في العديد من العمليات النووية15،16 ومترجمة بشكل فريد إلى التيلوميرات ALT لتشكيل APBs ، لأجسام PML المرتبطة التيلومير ALT17،18. التيلوميرات الكتلة داخل APBs، ويفترض أن توفر قوالب إصلاح لتوليف الحمض النووي التيلومير الموجهة homology في ALT19. في الواقع، تم الكشف عن تخليق الحمض النووي التيلومير في APBs وAPBs تلعب أدوارا أساسية في إثراء عوامل إصلاح الحمض النووي على التيلوميرات20،21. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء تجميع APB وتتجمع التيلومير داخل APBs غير معروفة. منذ يتم تعديل بروتينات التيلومير في خلايا ALT بشكل فريد من قبل معدل صغير يشبه في كل مكان (SUMOs)22، تحتوي العديد من مكونات APB على مواقع السومويل 22و23و24و25 و / أو الزخارف التفاعل السومو (SIMs)26،27 والتفاعلات سومو سيم محرك مرحلة الفصل28، افترضنا أن السومويل على التيلوميرات يؤدي إلى إثراء سومو / سيم التي تحتوي على البروتينات و وتؤدي تفاعلات السومو-سيم بين تلك البروتينات إلى فصل المرحلة. يمكن تجنيد بروتين PML ، الذي يحتوي على ثلاثة مواقع للسومويليشن وموقع SIM واحد ، إلى التيلوميرات السومويلات لتشكيل APBs ويؤدي تجمع APBs السائل إلى تجمع التيلوميرات. لاختبار هذه الفرضية، استخدمنا نظام التعتيم الكيميائي لمحاكاة تشكيل APB الناجم عن السومويل عن طريق تجنيد SIM إلى التيلوميرات (الشكل 2A)11. يتم دمج GFP إلى Haloenzyme للتصور وبروتين TRF1 الملزم للتيلومير لترسيخ جهاز التعتيم على التيلوميرات. يتم دمج SIM إلى eDHFR و mCherry. ويتبع الحركية من تشكيل المكثفات والتيلومير الناجم عن الانصهار القطيرات التجمع مع التصوير بالخلايا الحية. يتم عكس فصل المرحلة بإضافة TMP مجانية زائدة للتنافس مع ربط eDHFR. تستخدم الفلورة المناعية (IF) والفلورة في التهجين الموقعي (FISH) لتحديد تكوين المكثفات وارتباط التلوميريك. تجنيد SIM يثري سومو على التيلوميرات والمكثفات المستحثة تحتوي على PML وبالتالي فهي APBs. إن تجنيد متحول SIM لا يمكنه التفاعل مع SUMO لا يثري SUMO على التيلوميرات أو يحفز فصل المرحلة ، مما يشير إلى أن القوة الدافعة الأساسية لتكثيف APB هي التفاعل بين SUMO و SIM. الاتفاق مع هذه الملاحظة، بوليسومو-بوليسيم البوليمرات التي تنصهر إلى عامل الربط TRF2 RAP1 يمكن أن تحفز أيضا تشكيل APB29. بالمقارنة مع نظام الانصهار polySUMO-polySIM حيث يحدث فصل المرحلة طالما يتم إنتاج ما يكفي من البروتينات، فإن نهج التعتيم الكيميائي المعروض هنا يحفز فصل المرحلة عند الطلب وبالتالي يوفر دقة زمنية أفضل لرصد حركية فصل المرحلة وعملية تجميع التيلومير. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح نظام التضويض الكيميائي هذا بتوظيف بروتينات أخرى لتقييم قدرتها على الحث على فصل الطور وتتجمع التيلومير. على سبيل المثال ، يمكن للبروتين المضطرب الذي يتم تجنيده في التيلوميرات أيضا تشكيل قطرات وتلوميرات عنقودية دون تحفيز تكوين APB ، مما يشير إلى أن تجمع التيلومير مستقل عن كيمياء APB ويعتمد فقط على الخاصية السائلة APB11.
Protocol
Representative Results
Discussion
أظهر هذا البروتوكول تشكيل وانحلال المكثفات على التيلوميرات بنظام التعتيم الكيميائي. يتم رصد الحركية من فصل المرحلة والتيلومير الناجم عن الانصهار القطيرات التجمع مع التصوير الحي. يتم تحديد توطين المكثفات وتكوينها مع الحمض النووي السمك والبروتين IF.
هناك خطوتان حاسمتان في ه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (1K22CA23763201 إلى H.Z. و GM118510 إلى D.M.C)ومؤسسة تشارلز كوفمان إلى H.Z. ويود المؤلفون أن يشكروا جيسون تونز على التدقيق في المخطوطة.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Sabari, B. R., Dall’Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
- McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
- Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
- Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
- Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
- Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
- Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
- Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
- Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
- Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
- Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
- Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
- Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
- Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
- Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
- Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
- Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
- Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
- Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
- Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
- Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
- Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
- Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
- Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
- Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 – Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
- Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
- Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
- Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
- Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
- Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).
