Condensats de protéines induits par dimérisation chimique sur les télomères

Summary

Ce protocole illustre un système de dimérisation des protéines induit chimiquement pour créer des condensats sur la chromatine.  La formation d’un corps nucléaire de leucémie promyélocytaire (LEMP) sur des télomères avec des dimériseurs chimiques est démontrée. La croissance, la dissolution, la localisation et la composition des gouttelettes sont surveillées par imagerie cellulaire vivante, immunofluorescence (IF) et hybridation in situ par fluorescence (FISH).

Abstract

Les condensats associés à la chromatine sont impliqués dans de nombreux processus nucléaires, mais les mécanismes sous-jacents restent insaisissables. Ce protocole décrit un système de dimérisation des protéines induit chimiquement pour créer des condensats sur les télomères. Le dimériseur chimique se compose de deux ligands liés qui peuvent chacun se lier à une protéine: le ligand Halo à Halo-enzyme et le triméthoprime (TMP) à E. coli dihydrofolate réductase (eDHFR), respectivement. La fusion de l’enzyme Halo à une protéine télomère ancre les dimériseurs aux télomères par liaison covalente ligand-enzyme Halo. La liaison du TMP à l’eDHFR recrute la phase fusionnée de l’eDHFR séparant les protéines en télomères et induit la formation de condensats. Étant donné que l’interaction TMP-eDHFR n’est pas covalente, la condensation peut être inversée en utilisant un excès de TMP libre pour concurrencer le dimériseur pour la liaison eDHFR. Un exemple d’induction de la formation du corps nucléaire de la leucémie promyélocytaire (LEMP) sur les télomères et de détermination de la croissance, de la dissolution, de la localisation et de la composition des condensats est montré. Cette méthode peut être facilement adaptée pour induire des condensats à d’autres endroits génomiques en fusionnant Halo à une protéine qui se lie directement à la chromatine locale ou à dCas9 qui cible le locus génomique avec un ARN guide. En offrant la résolution temporelle requise pour l’imagerie en direct unicellulaire tout en maintenant la séparation de phase dans une population de cellules pour les essais biochimiques, cette méthode convient pour sonder à la fois la formation et la fonction des condensats associés à la chromatine.

Introduction

De nombreuses protéines et acides nucléiques subissent une séparation de phase liquide-liquide (LLPS) et s’auto-assemblent en condensats biomoléculaires pour organiser la biochimie dans les cellules^1,2. Le LLPS des protéines de liaison à la chromatine conduit à la formation de condensats associés à des loci génomiques spécifiques et impliqués dans diverses fonctions locales de la chromatine³. Par exemple, LLPS de la protéine HP1 sous-tend la formation de domaines hétérochromatiques pour organiser le génome^4,5,LLPS des facteurs de transcription forme des centres de transcription pour réguler la transcription^6,LLPS des ARNm naissants et des combinaisons multisensiques la protéine génère des corps de locus histones pour réguler la transcription et le traitement des ARNm d’histones^7.  Cependant, malgré la découverte de nombreux exemples de condensats associés à la chromatine, les mécanismes sous-jacents de la formation, de la régulation et de la fonction des condensats restent mal compris. En particulier, tous les condensats associés à la chromatine ne sont pas formés par LLPS et des évaluations minutieuses de la formation de condensats dans les cellules vivantes sont encore nécessaires^8,9. Par exemple, il est démontré que la protéine HP1 chez la souris n’a qu’une faible capacité à former des gouttelettes liquides dans les cellules vivantes et que les foyers d’hétérochromatine se comportent comme des globules polymères effondrés¹⁰. Par conséquent, des outils pour induire des condensats de novo sur la chromatine dans les cellules vivantes sont souhaitables, en particulier ceux qui permettent l’utilisation de l’imagerie en direct et des essais biochimiques pour surveiller la cinétique de la formation de condensats, les propriétés physiques et chimiques des condensats résultants et les conséquences cellulaires de la formation de condensats.

Ce protocole rapporte un système de dimérisation chimique pour induire des condensats de protéines sur la chromatine¹¹ (Figure 1A). Le dimériseur se compose de deux ligands liés interagissant avec les protéines: le triméthoprime (TMP) et le ligand Halo et peut dimériser des protéines fusionnées aux récepteurs apparentés: Escherichia coli dihydrofolate réductase (eDHFR) et une enzyme alkyldéhalogénase bactérienne (enzyme Halo), respectivement¹². L’interaction entre le ligand Halo et l’enzyme Halo est covalente, ce qui permet à l’enzyme Halo d’être utilisée comme ancre en la fusionnant à une protéine liant la chromatine pour recruter une protéine de séparation de phase fusionnée à l’eDHFR en chromatine. Après le recrutement initial, une concentration locale accrue de la protéine séparatrice de phase dépasse la concentration critique nécessaire à la séparation de phase et nuclée ainsi un condensat à l’ancre(Figure 1B). En fusionnant des protéines fluorescentes (par exemple mCherry et eGFP) à eDHFR et Halo, la nucléation et la croissance des condensats peuvent être visualisées en temps réel avec la microscopie à fluorescence. Étant donné que l’interaction entre l’eDHFR et le TMP n’est pas covalente, un excès de TMP libre peut être ajouté pour concurrencer le dimériseur pour la liaison eDHFR. Cela libérera ensuite la protéine de séparation de phase de l’ancre et dissoudra le condensat associé à la chromatine.

Nous avons utilisé cet outil pour induire la formation du corps nucléaire de la leucémie promyélocytaire de novo (LEMP) sur les télomères dans les cellules cancéreuses à télomérase négative qui utilisent une voie alternative d’allongement des télomères (ALT) pour le maintien des télomères^13,14.  Les corps nucléaires PML sont des compartiments sans membrane impliqués dans de nombreux processus nucléaires^15,16 et sont localisés de manière unique aux télomères ALT pour former des APM, pour les corps PML associés aux télomères ALT^17,18. Les télomères se regroupent dans les ABC, probablement pour fournir des modèles de réparation pour la synthèse de l’ADN télomère dirigée par homologie dans ALT¹⁹. En effet, la synthèse de l’ADN télomère a été détectée dans les ABC et les ABC jouent un rôle essentiel dans l’enrichissement des facteurs de réparation de l’ADN sur les télomères^20,21. Cependant, les mécanismes sous-jacents à l’assemblage APB et au clustering des télomères au sein des APB étaient inconnus. Étant donné que les protéines télomères dans les cellules ALT sont modifiées de manière unique par de petits modificateurs de type ubiquitine (SUMOs)²², de nombreux composants APB contiennent des sites desumoylation ^22,23,^{24 ,}25 et / ou des motifs interagissant SUMO (SIM)^26,27 et des interactions SUMO-SIM conduisent à la séparation de phase²⁸, nous avons émis l’hypothèse que la sumoylation sur les télomères conduit à l’enrichissement des protéines contenant SUMO / SIM et Les interactions SUMO-SIM entre ces protéines conduisent à une séparation de phase.  La protéine PML, qui a trois sites de sumoylation et un site SIM, peut être recrutée dans les télomères sumoyés pour former des ABC et la coalescence des ABC liquides conduit au regroupement des télomères. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé le système de dimérisation chimique pour imiter la formation d’APB induite par la sumoylation en recrutant des CARTES SIM pour les télomères(Figure 2A)^11. Le GFP est fusionné à Haloenzyme pour la visualisation et à la protéine de liaison aux télomères TRF1 pour ancrer le dimériseur aux télomères. La carte SIM est fusionnée à eDHFR et mCherry. La cinétique de la formation de condensats et le regroupement de télomères induit par la fusion de gouttelettes sont suivis par l’imagerie de cellules vivantes.  La séparation de phase est inversée en ajoutant un excès de TMP libre pour concurrencer la liaison eDHFR. L’immunofluorescence (FI) et l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) sont utilisées pour déterminer la composition du condensat et l’association télomérique. Le recrutement de SIM enrichit le SUMO sur les télomères et les condensats induits contiennent du PML et sont donc des APM. Le recrutement d’un mutant SIM qui ne peut pas interagir avec SUMO n’enrichit pas SUMO sur les télomères ni n’induit de séparation de phase, ce qui indique que la force motrice fondamentale de la condensation APB est l’interaction SUMO-SIM. En accord avec cette observation, les polymères polySUMO-polySIM qui fusionnent à un facteur de liaison TRF2 RAP1 peuvent également induire la formation d’APB^29. Par rapport au système de fusion polySUMO-polySIM où la séparation de phase se produit tant que suffisamment de protéines sont produites, l’approche de dimérisation chimique présentée ici induit une séparation de phase à la demande et offre ainsi une meilleure résolution temporelle pour surveiller la cinétique de la séparation de phase et du processus de regroupement des télomères. De plus, ce système de dimérisation chimique permet le recrutement d’autres protéines pour évaluer leur capacité à induire la séparation de phase et le regroupement des télomères. Par exemple, une protéine désordonnée recrutée dans les télomères peut également former des gouttelettes et des télomères de cluster sans induire la formation d’APB, ce qui suggère que le regroupement des télomères est indépendant de la chimie de l’APB et ne repose que sur la propriété liquide de l’APB¹¹.

Protocol

1. Production de lignées cellulaires transitoires Culture de cellules acceptrices U2OS sur des couvercles en verre de 22 x 22 mm (pour l’imagerie vivante) ou des couvercles circulaires de 12 mm de diamètre (pour IF ou FISH) recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à 6 puits avec milieu de croissance (10% de sérum bovin fœtal et 1% de solution de pénicilline-streptomycine dans DMEM) jusqu’à ce qu’ils atteignent 60-70% de confluence. Remplacer le milieu de croissance par…

Representative Results

Des images représentatives de la localisation télomérique de SUMO identifiées par l’ADN télomère FISH et la protéine SUMO IF sont montrées à la figure 2. Les cellules à recrutement SIM enrichissent SUMO1 et SUMO 2/3 sur télomères par rapport aux cellules à recrutement mutant SIM. Cela indique que l’enrichissement SUMO induit par la dimérisation SIM sur les télomères dépend des interactions SUMO-SIM. Un film en accéléré représentatif de TRF…

Discussion

Ce protocole a démontré la formation et la dissolution de condensats sur des télomères avec un système de dimérisation chimique. La cinétique de la séparation de phase et du regroupement des télomères induit par la fusion de gouttelettes est surveillée par imagerie en direct. La localisation et la composition des condensats sont déterminées avec l’ADN FISH et la protéine IF.

Ce protocole présente deux étapes critiques. La première consiste à déterminer la concentration en …

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906	Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate	VWR	10861-554
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-101
Anti-mCherry antibody	Abcam	Ab183628
Anti-PML antibody	Santa Cruz	sc966
Anti-SUMO1 antibody	Abcam	Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody	Cytoskeleton	Asm23
Blocking Reagent	Roche	11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML	VWR	89511-258
Circle Cover Slips	Thermo Scientific	3350
Confocal microscope	Nikon	MQS31000
DAPI	Fisher Scientific	D1306
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10017CV
EMCCD Camera	iXon Life	897
Ethanol	Fisher Scientific	4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions	Gibco	A4766801
Formamide, Deionized	MilliporeSigma	46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Laser merge module	Nikon	NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668027
Figure plotting software, MATLAB	The MathWorks
Microscope Slide Box	Fisher Scientific	34487
Nail Polish	Fisher Scientific	50-949-071
Imaging software, NIS-Elements	Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media	Gibco	51985091
Parafilm	Bemis	13-374-12
PBS 10x, pH 7.4	Fisher Scientific	70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X	Gibco	15140122
Piezo Z-Drive	Physik Instrumente (PI)	91985
Pipet Tips	VWR	10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides	Fisher Scientific	22-037-246
Poly-D-Lysine solution	Sigma-Aldrich	A-003-E
Sodium Azide	Fisher Scientific	BP922I-500
Spinning disk	Yokogawa	CSU-X1
Square Cover Slips	Thermo Scientific	3305
TBS 10x solution	Fisher Scientific	BP2471500
TelC-Alexa488	PNA Bio	F1004
TMP	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
TNH	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
Tris Solution	Fisher Scientific	92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution	MilliporeSigma	64-846-350ML	Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line	From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)	HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	NC9524612