텔로미어의 화학적 이산화 유발 단백질 응축수
Summary
이 프로토콜은 크로마틴에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이질화를 보여줍니다. 화학 이량제와 텔로미어에 대미원식 백혈병 (PML) 핵 체의 형성이 입증된다. 물방울 성장, 용해, 국소화 및 조성물은 살아있는 세포 이미징, 면역 형광 (IF) 및 시상 혼성화 (FISH)에서 형광으로 모니터링됩니다.
Abstract
크로마틴 관련 응축수는 많은 핵 프로세스에 연루되어 있지만 기본 메커니즘은 여전히 애매합니다. 이 프로토콜은 텔로미어에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이압 시스템을 설명합니다. 화학 이량제는 각각 단백질에 결합할 수 있는 두 개의 연결된 리간드로 구성됩니다: 헤일로 리간드에서 헤일로 효소 및 트리메토림(TMP)에서 대장균 디하이드로폴레이트 환원효소(eDHFR)에 각각 결합한다. Halo 효소를 텔로미어 단백질에 융합하여 이머제는 공유 헤일로 리간드 효소 결합을 통해 텔로미어에 이질화합니다. eDHFR에 TMP의 결합은 텔로미어에 단백질을 분리하는 eDHFR 융합 상을 모집하고 응축수 형성을 유도합니다. TMP-eDHFR 상호 작용은 비 공유이기 때문에, 응축은 eDHFR 바인딩을 위한 이질제와 경쟁하기 위하여 초과 자유로운 TMP를 사용하여 반전될 수 있습니다. 텔로미어에 대한 보골세포 백혈병(PML) 핵체 형성을 유도하고 응축수 성장, 용해, 국소화 및 조성물을 결정하는 예가 도시된다. 이 방법은 Halo를 현지 크로마틴에 직접 결합하는 단백질또는 가이드 RNA와 게놈 궤적을 대상으로 하는 dCas9에 직접 결합하는 단백질에 융합하여 다른 게놈 위치에서 응축을 유도하도록 쉽게 적응할 수 있다. 생화학적 분석을 위한 세포의 인구에서 위상 분리를 유지하면서 단하나 세포 라이브 이미징에 필요한 시간적 분해를 제공함으로써, 이 방법은 크로마틴 관련 응축수의 형성과 기능을 모두 조사하는 데 적합합니다.
Introduction
많은 단백질과 핵산은 액체-액체 상 분리(LLPS)를 거치고 세포1,2에서생화학을 조직하기 위해 생분자 응축수로 자가 조립한다. 크로마틴 결합 단백질의 LLPS는 특정 게놈 loci와 연관되고 각종 국소 크로마틴 기능에 연루되는 응축수의 형성에 이끌어 냅니다3. 예를 들어, HP1 단백질의 LLPS는 게놈4,5,전사 인자의 LLPS를 구성하는 이종로크로마티닌 도메인의 형성을 기초로 하여 전사6,초기 mRNA및 다성 빗 단백질의 LLPS는 그의 mRNA의 전사 및처리를 조절하기 위해 그의 음색 궤적 바디를 생성한다. 그러나 크로마틴 관련 응축수의 많은 예가 발견되었음에도 불구하고 응축수 형성, 조절 및 기능의 기본 메커니즘은 제대로 이해되지 않습니다. 특히, 모든 크로마틴 관련 응축수들이 LLPS를 통해 형성되는 것은 아니며 살아있는 세포에서 응축수 형성에 대한 신중한 평가는 여전히8,9가필요하다. 예를 들어, 마우스의 HP1 단백질은 살아있는 세포에서 액체 방울을 형성하는 데 약한 용량만 있는 것으로 나타났으며 이종로그로마틴 포시는 붕괴된 폴리머소구(10)로행동한다. 따라서, 살아있는 세포에서 크로마틴에 드 노보 응축수를 유도하는 도구는 바람직하며, 특히 살아있는 화상 진찰 및 생화학 적 분석의 사용을 허용하여 응축수 형성의 운동, 결과 응축수의 물리적 및 화학적 특성 및 응축수 형성의 세포 결과를 모니터링 할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
이러한 프로토콜은 크로마틴11(도 1A)에단백질 응축수를 유도하는 화학 적 이질 시스템을 보고합니다. 이산화제는 두 개의 연결된 단백질 상호 작용 리간드로 구성되어 있습니다: 트리메토림(TMP)과 헤일로 리간드와 코냑 수용체에 융합된 단백질을 이질할 수 있습니다: 에젤리치아 대장균 디하이드로폴레이트 환원효소(eDHFR) 및 세균성 알킬데할로게나아제 효소(Halo enzyme), 각각12. Halo 리간드와 헤일로 효소 간의 상호 작용은 공유되며, Halo 효소는 크로마틴결합 단백질에 융합하여 eDHFR에 융합된 위상 분리 단백질을 크로마틴에 모집함으로써 앵커로 사용될 수 있게 합니다. 초기 모집 후, 단백질을 분리하는 상의 국소 농도가 증가하여 위상 분리에 필요한 임계 농도를 전달하여앵커(도 1B)에서응축수를 핵을 형성한다. 형광 단백질(예: mCherry 및 eGFP)을 eDHFR 및 Halo에 융합함으로써 응축수의 핵 형성 및 성장을 형광 현미경 검사법과 실시간으로 시각화할 수 있습니다. eDHFR과 TMP 간의 상호 작용은 비공유이기 때문에, 초과 무료 TMP는 eDHFR 바인딩을 위한 이질화와 경쟁하기 위하여 추가될 수 있다. 그러면 앵커로부터 위상 분리 단백질을 방출하고 크로마틴 관련 응축수용을 용해시킬 것이다.
우리는 텔로미어 유지보수를위한 텔로미어(ALT) 경로의 대체 길이를 사용하는 텔로머라제-음성 암 세포에서 텔로미어에 대한 드 노보 보골 성 백혈병(PML) 핵체 형성을 유도하기 위해 이 도구를사용했다. PML 핵체는 많은 핵 공정에 관여하는 멤브레인이 없는 구획으로,ALT텔로미어 관련 PML체(17,18)에대해 APB를 형성하기 위해 ALT 텔로미어로 고유하게 국한된다. 아마도 ALT19에서homology 지향 텔로미어 DNA 합성을 위한 복구 템플릿을 제공하기 위하여, APBs 내의 텔로미어 클러스터. 실제로, 텔로미어 DNA 합성은 APBs에서 검출되고 APBs는 텔로미어20,21에DNA 복구 요인을 풍부하게 하는 데 필수적인 역할을 한다. 그러나 APB 어셈블리와 알토미어 클러스터링의 기본 메커니즘은 알 수 없었습니다. ALT 세포내 텔로미어 단백질은 작은 유비퀴틴 유사 수정제(SUMOs)22에의해 고유하게 변형되기 때문에, 많은 APB 성분은 스모일레이션 사이트(22,23,24,25 및/또는 SUMO)를 함유하고 있습니다. 상호 작용하는 모티프(SEM)26,27 및 SUMO-SIM 상호 작용은 위상 분리28을구동하며, 텔로미어의 스모틸화는 단백질을 함유한 SUMO/SIM의 농축으로 이어진다고 가설을 세우고 이러한 단백질 간의 SUMO-SIM 상호 작용은 위상 분리로 이어집니다. 3개의 스모일화 사이트와 1개의 SIM 사이트가 있는 PML 단백질은, APB를 형성하기 위하여 스모이드텔로미어로 모집될 수 있고 액체 APB의 결합은 텔로미어 클러스터링으로 이끌어 냅니다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, 우리는 텔로미어에 SIM을 모집하여 스모닐화 유도 APB 형성을 모방하기 위해 화학 적 이질화를 사용했다(도 2A)11. GFP는 시각화를 위해 Haloenzyme및 텔로미어 결합 단백질 TRF1에 융합되어 이질제를 텔로미어에 고정시합니다. SIM은 eDHFR과 mCherry에 융합됩니다. 응축수 형성 및 액적 융합 유도 텔로미어 클러스터링의 운동제는 살아있는 세포 이미징으로 뒤따릅니다. 단계 분리는 eDHFR 바인딩과 경쟁하기 위해 초과 무료 TMP를 추가하여 반전됩니다. 피시테 혼성화(FISH)에서의 면역형광(IF) 및 형광은 응축수 조성물 및 텔로메릭 협회를 결정하는 데 사용된다. SIM을 모집하면 텔로미어에서 SUMO가 풍부하게 되며 유도된 응축수에는 PML이 포함되어 있으므로 APB가 포함됩니다. SUMO와 상호 작용할 수 없는 SIM 돌연변이를 모집해도 텔로미어에서 SUMO가 풍부하게 하거나 위상 분리를 유도하지 않으며, 이는 APB 응축의 기본 추진력이 SUMO-SIM 상호작용임을 나타낸다. 이러한 관찰에 동의하면, TRF2 결합인자 RAP1에 융합된 폴리스모 폴리머는 또한 APB형성(29)을유도할 수 있다. 상 분리가 충분한 단백질이 생산되는 한 위상 분리가 발생하는 polySUMO-polySIM 융합 시스템에 비해, 여기에 제시된 화학 적 이질 접근법은 수요에 대한 위상 분리를 유도하고 따라서 상 분리 및 텔로미어 클러스터링 공정의 운동을 모니터링하는 더 나은 시간적 해결을 제공한다. 또한, 이 화학 적 이산화 시스템은 위상 분리 및 텔로미어 클러스터링을 유도하는 능력을 평가하기 위해 다른 단백질의 모집을 허용합니다. 예를 들어, 텔로미어에 채용된 무질서한 단백질은 APB 형성을 유도하지 않고 방울과 클러스터 텔로미어를 형성할 수 있으며, 텔로미어 클러스터링은 APB 화학과 무관하며 APB 액체특성(11)에만의존한다는 것을 시사한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 화학 적 분수 시스템을 갖춘 텔로미어의 응축수 형성 및 용해를 입증했습니다. 상 분리 및 액적 융합 유도 텔로미어 클러스터링의 운동은 라이브 이미징으로 모니터링됩니다. 응축수 국소화 및 조성물은 DNA FISH 및 단백질 IF로 결정됩니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 단백질과 이량제 농도를 결정하는 것입니다. 게놈 궤적에서 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 국립 보건원 (1K22CA23763201 H.Z., GM118510에서 D.M.C.) 및 찰스 E. 카우프만 재단에 의해 지원되었다. 저자는 원고를 교정제이슨 톤에게 감사드립니다.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
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