Этот протокол иллюстрирует химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на хроматине. Показано образование ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах с химическими димеризаторами. Рост, растворение, локализацию и состав капель контролируются с помощью визуализации живых клеток, иммунофлуоресценции (IF) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Хроматин-ассоциированные конденсаты участвуют во многих ядерных процессах, но лежащие в их основе механизмы остаются неуловимыми. Этот протокол описывает химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на теломерах. Химический димеризатор состоит из двух связанных лигандов, каждый из которых может связываться с белком: галолиганд с гало-ферментом и триметоприм (TMP) с дигидрофолатредуктазой E. coli (eDHFR), соответственно. Слияние фермента Halo с теломерным белком прикрепляет димеризаторы к теломерам посредством ковалентного связывания Halo лиганд-фермент. Связывание TMP с eDHFR рекрутирует eDHFR-плавленую фазу, разделяющую белки на теломеры, и индуцирует образование конденсата. Поскольку взаимодействие TMP-eDHFR является нековалентным, конденсацию можно обратить вспять, используя избыточный свободный TMP, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Приведен пример индуцирования образования ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах и определения роста, растворения, локализации и состава конденсата. Этот метод может быть легко адаптирован для индуцирования конденсатов в других геномных местах путем слияния Halo с белком, который непосредственно связывается с местным хроматином или с dCas9, который нацелен на геномный локус с направляющей РНК. Предлагая временное разрешение, необходимое для визуализации одиночных клеток в реальном времени, сохраняя при этом разделение фаз в популяции клеток для биохимических анализов, этот метод подходит для исследования как образования, так и функции конденсатов, связанных с хроматином.
Многие белки и нуклеиновые кислоты подвергаются разделению жидкой фазы (LLPS) и самособираются в биомолекулярные конденсаты для организации биохимии в клетках1,2. LLPS хроматинсвязывающих белков приводит к образованию конденсатов, которые связаны со специфическими геномными локусами и участвуют в различных функциях местного хроматина3. Например, ТОО белка HP1 лежит в основе формирования гетерохроматиновых доменов для организации генома4,5,ТООО факторов транскрипции формирует транскрипционные центры для регулирования транскрипции6,ТОО из зарождающихся мРНК и белков многополых генерирует гистоновые локусные тела для регулирования транскрипции и обработки гистоновых мРНК7. Однако, несмотря на то, что было обнаружено много примеров хроматин-ассоциированных конденсатов, основные механизмы образования, регуляции и функции конденсата остаются плохо изученными. В частности, не все хроматин-ассоциированные конденсаты образуются через LLPS и тщательные оценки образования конденсата в живых клетках все еще необходимы8,9. Например, показано, что белок HP1 у мышей обладает лишь слабой способностью образовывать жидкие капли в живых клетках, а гетерохроматиновые очаги ведут себя как коллапсировавших полимерныхшариков 10. Поэтому желательны инструменты для индуцирования конденсатов de novo на хроматине в живых клетках, особенно те, которые позволяют использовать живую визуализацию и биохимические анализы для мониторинга кинетики образования конденсата, физических и химических свойств образующихся конденсатов и клеточных последствий образования конденсата.
Этот протокол сообщает о системе химической димеризации для индуцирования белковых конденсатов на хроматине11 (рисунок 1A). Димеризатор состоит из двух связанных белково-взаимодействующих лигандов: триметоприма (TMP) и лиганда Halo и может димеризовать белки, слитые с родственными рецепторами: Escherichia coli дигидрофолатредуктаза (eDHFR) и бактериальный фермент алкилдегалогеназа (фермент Halo), соответственно12. Взаимодействие между лигандом Halo и ферментом Halo является ковалентным, что позволяет использовать фермент Halo в качестве якоря путем слияния его с хроматин-связывающим белком для набора фазоразделяющего белка, слитого с eDHFR с хроматином. После первоначального набора повышенная локальная концентрация белка, разделяющего фазы, проходит критическую концентрацию, необходимую для разделения фаз, и, таким образом, зародывает конденсат на якоре(рисунок 1В). Путем слияния флуоресцентных белков (например, mCherry и eGFP) с eDHFR и Halo, нуклеация и рост конденсатов могут быть визуализированы в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Поскольку взаимодействие между eDHFR и TMP является нековалентным, избыток свободного TMP может быть добавлен, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Затем это высвобождает белок разделения фаз из якоря и растворяет конденсат, связанный с хроматином.
Мы использовали этот инструмент для индуцирования образования ядерного тела de novo промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах в теломераз-отрицательных раковых клетках, которые используют альтернативное удлинение пути теломер (АЛТ) для поддержания теломер13,14. Ядерные тела ПМЛ представляют собой безмембранные компартменты, участвующие во многих ядерных процессах15,16 и уникально локализованные в теломерах АЛТ с образованием АПП, для АЛТ теломер-ассоциированных тел ПМЛ17,18. Теломеры группируются в APB, по-видимому, для предоставления шаблонов восстановления для синтеза ДНК теломер, направленных на гомологию, в ALT19. Действительно, синтез ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК был обнаружен в APB, и APB играют важную роль в обогащении факторов репарации ДНК на теломерах20,21. Однако механизмы, лежащие в основе сборки APB и кластеризации теломер в APB, были неизвестны. Поскольку белки теломер в АЛТ-клетках уникально модифицированы небольшим убиквитиноподобным модификатором (SUMO)22,многие компоненты APB содержат участки сумоилирования 22,23,24,25 и/или SUMO-взаимодействующие мотивы (SIM)26,27 и взаимодействия SUMO-SIM управляют разделением фаз28,мы предположили, что сумоилирование на теломерах приводит к обогащению SUMO/SIM-содержащих белков и Взаимодействия SUMO-SIM между этими белками приводят к разделению фаз. Белок PML, который имеет три участка сумоилирования и один сайт SIM, может быть рекрутирован в сумоилированные теломеры для образования APB, а слияние жидких APB приводит к кластеризации теломер. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали систему химической димеризации для имитации образования APB, вызванного сумоилированием, путем набора SIM в теломеры(рисунок 2A)11. GFP сплавляется с Haloenzyme для визуализации и с теломер-связывающим белком TRF1 для закрепления димеризатора на теломерах. SIM-карта слита с eDHFR и mCherry. Кинетика образования конденсата и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, сопровождается визуализацией живых клеток. Разделение фаз обменяется путем добавления избыточного свободного TMP, чтобы конкурировать с связыванием eDHFR. Иммунофлуоресценция (IF) и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) используются для определения состава конденсата и теломерной ассоциации. Рекрутинговая SIM обогащает SUMO на теломерах, а индуцированные конденсаты содержат PML и, следовательно, являются APB. Вербовка SIM-мутанта, который не может взаимодействовать с SUMO, не обогащает SUMO на теломерах и не индуцирует разделение фаз, что указывает на то, что фундаментальной движущей силой конденсации APB является взаимодействие SUMO-SIM. Соглашаясь с этим наблюдением, полимеры polySUMO-polySIM, которые сплавились с фактором связывания TRF2 RAP1, также могут индуцировать образование APB29. По сравнению с системой синтеза polySUMO-polySIM, где разделение фаз происходит до тех пор, пока производится достаточное количество белков, подход химической димеризации, представленный здесь, индуцирует разделение фаз по требованию и, таким образом, предлагает лучшее временное разрешение для мониторинга кинетики разделения фаз и процесса кластеризации теломер. Кроме того, эта система химической димеризации позволяет рекрутировать другие белки для оценки их способности индуцировать разделение фаз и кластеризацию теломер. Например, неупорядоженный белок, рекрутированный в теломеры, также может образовывать капли и кластерные теломеры, не вызывая образования APB, предполагая, что кластеризация теломер не зависит от химии APB и полагается только на жидкое свойство APB11.
Этот протокол продемонстрировал образование и растворение конденсатов на теломерах с помощью системы химической димеризации. Кинетика разделения фаз и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, контролируются с помощью живой визуализации. Локализацию и состав конденсата опр…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США (1K22CA23763201 до H.Z., GM118510 до D.M.C.) и Фондом Чарльза Э. Кауфмана для H.Z. Авторы хотели бы поблагодарить Джейсона Тонса за корректуру рукописи.
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
Pipet Tips | VWR | 10017 | |
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |