Kemiska dimeriseringsinducerade proteinkondensat på telomerer
Summary
Detta protokoll illustrerar ett kemiskt inducerat protein dimerization system för att skapa kondensat på kromatin. Bildandet av promyelocytic leukemi (PML) nukleära organ på telomerer med kemiska dimerizers visas. Dropptillväxt, upplösning, lokalisering och sammansättning övervakas med levande celltomografi, immunofluorescens (IF) och fluorescens in situ hybridisering (FISH).
Abstract
Kromatin-associerade kondensat är inblandade i många kärntekniska processer, men de underliggande mekanismerna förblir svårfångade. Detta protokoll beskriver ett kemiskt inducerad protein dimerization system för att skapa kondensat på telomerer. Den kemiska dimerizern består av två länkade ligands som var och en kan binda till ett protein: Halo ligand till Halo-enzym och trimethoprim (TMP) till E. coli dihydrofolate reduktas (eDHFR), respektive. Fusion av Halo enzym till en telomere protein ankar dimerizers till telomerer genom kovavalent Halo ligand-enzymbindning. Bindning av TMP till eDHFR rekryterar eDHFR-smält fas som separerar proteiner till telomerer och inducerar kondensatbildning. Eftersom TMP-eDHFR-interaktionen inte är kovavalent kan kondensen vändas genom att använda överskottsfri TMP för att konkurrera med dimerizern för eDHFR-bindning. Ett exempel på inducera promyelocytic leukemi (PML) nukleära organ bildas på telomerer och bestämma kondensat tillväxt, upplösning, lokalisering och sammansättning visas. Denna metod kan enkelt anpassas för att inducera kondensat på andra genomiska platser genom att integrera Halo till ett protein som direkt binder till det lokala kromatinet eller dCas9 som är riktat mot den genomiska locusen med en guide RNA. Genom att erbjuda den tidsmässiga upplösning som krävs för levande avbildning med en cell samtidigt som fasseparation bibehålls i en population av celler för biokemiska analyser, är denna metod lämplig för att probing både bildandet och funktionen av kromatin-associerade kondensat.
Introduction
Många proteiner och nukleinsyror genomgår vätske-flytande fasseparation (LLPS) och självmonteras i biomolekylära kondensat för att organisera biokemi icellerna 1,2. LLPS av kromatinbindande proteiner leder till bildandet av kondensater som är associerade med specifika genomiska lokus och är inblandade i olika lokala kromatinfunktioner3. Till exempel ligger LLPS av HP1-protein bakom bildandet av heterochromatindomäner för att organiseragenomet 4,5,LLPS av transkriptionsfaktorer bildar transkriptionscentra för att reglera transkription6,LLPS av gryende mRNAs och multikönat kammarprotein genererar histonlocuskroppar för att reglera transkription och bearbetning av histonmRNAs7. Men trots många exempel på kromatin-associerade kondensat upptäcks, de underliggande mekanismerna för kondensatbildning, reglering och funktion förblir dåligt förstådda. I synnerhet bildas inte alla kromatinrelaterade kondensat genom LLPS och noggranna utvärderingar av kondensatbildning i levande celler behövs fortfarande8,9. Till exempel, HP1 protein i musen visas ha endast en svag kapacitet att bilda flytande droppar i levande celler och heterochromatin högborgar beter sig som kollapsade polymerglobobuler10. Därför är verktyg för att inducera de novokondensat på kromatin i levande celler önskvärda, särskilt de som tillåter användning av levande avbildning och biokemiska analyser för att övervaka kinetiken av kondensatbildning, de fysiska och kemiska egenskaperna hos de resulterande kondensaterna och de cellulära konsekvenserna av kondensatbildning.
Detta protokoll rapporterar ett kemiskt dimeriseringssystem för att inducera proteinkondensat påkromatin 11 (figur 1A). Dimerizern består av två sammankopplade protein-interagerande ligands: trimethoprim (TMP) och Halo ligand och kan dimerize proteiner smälta till cognate receptorer: Escherichia coli dihydrofolate reduktas (eDHFR) och en bakteriell alkyldehalogenase enzym (Halo enzym),respektive 12. Interaktionen mellan Halo ligand och Halo-enzymet är kovam, vilket gör att Halo-enzymet kan användas som ankare genom att smälta det till ett kromatinbindande protein för att rekrytera ett fasavskiljande protein som smälts till eDHFR till kromatin. Efter den första rekryteringen passerar den ökade lokala koncentrationen av fasavskiljande protein den kritiska koncentration som behövs för fasseparation och kärnar därmed ett kondensat vid ankaret (figur 1B). Genom att fusing fluorescerande proteiner (t.ex. mCherry och eGFP) till eDHFR och Halo, nukleation och tillväxt av kondensat kan visualiseras i realtid med fluorescensmikroskopi. Eftersom interaktionen mellan eDHFR och TMP inte är kovam, kan överskottsfri TMP läggas till för att konkurrera med dimerizer för eDHFR-bindning. Detta frigör sedan fasseparationsproteinet från ankaret och löser upp det kromatinrelaterade kondensatet.
Vi använde detta verktyg för att inducera de novo promyelocytic leukemi (PML) nukleära organ bildas på telomerer i telomerasnegativa cancerceller som använder en alternativ förlängning av telomerer (ALT) väg för telomer underhåll13,14. PML-kärn- förkroppsligar är membran-mindre fack som är involverade i många kärn-bearbetar 15,16 och lokaliseras unikt till ALT telomeres för att bilda APBs, för ALT telomere-tillhörande PMLförkroppsligar 17,18. Telomerer kluster inom APB, förmodligen för att tillhandahålla reparation mallar för homology-riktade telomer DNA syntes i ALT19. Faktum är att telomer-DNA-syntes har upptäckts i APB och API: er spelar viktiga roller för att berika DNA-reparationsfaktorer på telomerer20,21. Mekanismerna bakom APB-sammansättning och telomerkluster inom API: er var dock okända. Eftersom telomerproteiner i ALT-celler är unikt modifierade av små ubiquitinliknande modifierare (SUMOs)22, innehåller många APB-komponenter sumoyleringsplatser 22,23,24,25 och / eller SUMO-interagerande motiv (SIMs)26,27 och SUMO-SIM interaktioner driver fasseparation28, vi antog att sumoylering på telomerer leder till berikning av SUMO / SIM som innehåller proteiner och SUMO-SIM-interaktioner mellan dessa proteiner leder till fasseparation. PML-protein, som har tre sumoyleringsplatser och en SIM-plats, kan rekryteras till sumoylaterade telomerer för att bilda APB och sammanförande av flytande APB leder till telomerkluster. För att testa denna hypotes använde vi det kemiska dimeriseringssystemet för att efterlikna sumoylering-inducerad EFTERKLÄDselbildning genom att rekrytera SIM till telomerer (Figur 2A)11. GFP är sammansmält till Haloenzyme för visualisering och till det telomerbindande proteinet TRF1 för att förankra dimerizern till telomerer. SIM-kortet är sammansmält till eDHFR och mCherry. Kinetik av kondensat bildas och dropp fusion-inducerad telomer kluster följs med levande cell imaging. Fasseparationen vänds genom att lägga till överflödig fri TMP för att konkurrera med eDHFR-bindning. Immunofluorescens (IF) och fluorescens in situ hybridisering (FISH) används för att bestämma kondensat sammansättning och telomeric associering. Rekrytering av SIM berikar SUMO på telomerer och de inducerade kondensaterna innehåller PML och är därför APB. Att rekrytera en SIM-mutant som inte kan interagera med SUMO berikar inte SUMO på telomerer eller inducerar fasseparation, vilket indikerar att den grundläggande drivkraften för APB-kondensation är SUMO-SIM-interaktion. Med denna iakttagelse kan polySUMO-polySIM-polymerer som smälts till en TRF2-bindningsfaktor RAP1 också inducera APB-formation29. Jämfört med polySUMO-polySIM fusionssystemet där fasseparation sker så länge tillräckligt med proteiner produceras, inducerar den kemiska dimeriseringsmetoden som presenteras här fasseparation på begäran och erbjuder därmed bättre temporal upplösning för att övervaka kinetiken för fasseparation och telomerklusterningsprocess. Dessutom tillåter detta kemiska dimeriseringssystem rekrytering av andra proteiner för att bedöma deras förmåga att inducera fasseparation och telomerkluster. Till exempel kan ett oordnat protein som rekryteras till telomerer också bilda droppar och kluster telomerer utan att inducera APB-bildning, vilket tyder på att telomerkluster är oberoende av APB-kemi och förlitar sig bara på APB flytande egendom11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll visade bildandet och upplösningen av kondensat på telomerer med ett kemisk dimerization system. Kinetik av fas separation och droplet-fusion-inducerad telomer kluster övervakas med levande imaging. Kondensatlokalisering och sammansättning bestäms med DNA FISH och protein IF.
Det finns två kritiska steg i det här protokollet. Den första är att bestämma protein- och dimerizerkoncentrationen. Framgången med att inducera lokal fasseparation vid en genomisk locus bygger p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health (1K22CA23763201 till H.Z., GM118510 till D.M.C.) och Charles E. Kaufman foundation till H.Z. Författarna vill tacka Jason Tones för korrekturläsningen av manuskriptet.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Sabari, B. R., Dall’Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
- McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
- Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
- Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
- Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
- Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
- Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
- Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
- Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
- Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
- Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
- Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
- Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
- Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
- Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
- Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
- Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
- Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
- Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
- Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
- Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
- Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
- Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
- Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
- Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 – Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
- Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
- Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
- Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
- Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
- Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).
