Condensati proteici indotti da dimerizzazione chimica sui telomeri
Summary
Questo protocollo illustra un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sulla cromatina. Viene dimostrata la formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri con dimerizzatori chimici. La crescita, la dissoluzione, la localizzazione e la composizione delle goccioline sono monitorate con imaging di cellule vive, immunofluorescenza (IF) e ibridazione fluorescente in situ (FISH).
Abstract
I condensati associati alla cromatina sono implicati in molti processi nucleari, ma i meccanismi sottostanti rimangono sfuggenti. Questo protocollo descrive un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sui telomeri. Il dimerizzatore chimico è costituito da due ligandi collegati che possono legarsi ciascuno a una proteina: il ligando Halo all’enzima Halo e il trimetoprim (TMP) all’E. coli diidrofolato reduttasi (eDHFR), rispettivamente. La fusione dell’enzima Halo in una proteina telomerica ancora i dimerizzatori ai telomeri attraverso il legame covalente legante-enzima Halo. Il legame del TMP all’eDHFR recluta proteine di fase fuse con eDHFR in telomeri e induce la formazione di condensa. Poiché l’interazione TMP-eDHFR non è covalente, la condensazione può essere invertita utilizzando TMP libero in eccesso per competere con il dimerizzatore per il legame eDHFR. Viene mostrato un esempio di induzione della formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri e determinazione della crescita, della dissoluzione, della localizzazione e della composizione del condensato. Questo metodo può essere facilmente adattato per indurre condensati in altre posizioni genomiche fondendo Halo con una proteina che si lega direttamente alla cromatina locale o a dCas9 che è mirato al locus genomico con un RNA guida. Offrendo la risoluzione temporale richiesta per l’imaging live di singole cellule mantenendo la separazione di fase in una popolazione di cellule per saggi biochimici, questo metodo è adatto per sondare sia la formazione che la funzione dei condensati associati alla cromatina.
Introduction
Molte proteine e acidi nucleici subiscono la separazione di fase liquido-liquido (LLPS) e si auto-assemblano in condensati biomolecolari per organizzare la biochimica nelle cellule1,2. LLPS delle proteine leganti la cromatina porta alla formazione di condensati associati a specifici loci genomici e implicati in varie funzioni locali della cromatina3. Ad esempio, LLPS della proteina HP1 è alla base della formazione di domini eterocromatici per organizzare il genoma4,5, LLPS di fattori di trascrizione forma centri di trascrizione per regolare la trascrizione6, LLPS di mRNA nascenti e la proteina pettini multi-sesso genera corpi locus istoni per regolare la trascrizione e l’elaborazione degli mRNA istoni7. Tuttavia, nonostante siano stati scoperti molti esempi di condensati associati alla cromatina, i meccanismi alla base della formazione, della regolazione e della funzione del condensato rimangono poco compresi. In particolare, non tutti i condensati associati alla cromatina si formano attraverso LLPS e sono ancora necessarie attente valutazioni della formazione di condensa nelle cellule vive8,9. Ad esempio, la proteina HP1 nel topo ha dimostrato di avere solo una debole capacità di formare goccioline liquide nelle cellule vive e i focolai di eterocromatina si comportano come globuli polimerici collassati10. Pertanto, sono auspicabili strumenti per indurre condensati de novo sulla cromatina nelle cellule viventi, in particolare quelli che consentono l’uso di imaging dal vivo e saggi biochimici per monitorare la cinetica della formazione di condensa, le proprietà fisiche e chimiche dei condensati risultanti e le conseguenze cellulari della formazione di condensa.
Questo protocollo riporta un sistema di dimerizzazione chimica per indurre condensati proteici sulla cromatina11 (Figura 1A). Il dimerizzatore è costituito da due ligandi leganti che interagiscono con le proteine: trimetoprim (TMP) e ligando Halo e può dimerizzare proteine fuse ai recettori affini: Escherichia coli diidrofolato reduttasi (eDHFR) e un enzima alchilldehalogenasi batterico (enzima Halo), rispettivamente12. L’interazione tra il ligando Halo e l’enzima Halo è covalente, consentendo all’enzima Halo di essere utilizzato come ancoraggio fondendolo con una proteina legante la cromatina per reclutare una proteina che separa la fase fusa in eDHFR alla cromatina. Dopo il reclutamento iniziale, l’aumento della concentrazione locale della proteina che separa la fase passa la concentrazione critica necessaria per la separazione di fase e quindi nuclea un condensato all’ancora (Figura 1B). Fondendo proteine fluorescenti (ad es. mCherry ed eGFP) in eDHFR e Halo, la nucleazione e la crescita dei condensati possono essere visualizzate in tempo reale con la microscopia a fluorescenza. Poiché l’interazione tra eDHFR e TMP non è covalente, è possibile aggiungere TMP libero in eccesso per competere con il dimerizzatore per il legame eDHFR. Questo rilascerà quindi la proteina di separazione di fase dall’ancora e dissolverà il condensato associato alla cromatina.
Abbiamo usato questo strumento per indurre de novo la formazione di corpi nucleari da leucemia promielocitica (PML) sui telomeri nelle cellule tumorali negative alla telomerasi che utilizzano un allungamento alternativo dei telomeri (ALT) per il mantenimento dei telomeri13,14. I corpi nucleari PML sono compartimenti senza membrana coinvolti in molti processi nucleari15,16 e sono localizzati in modo univoco nei telomeri ALT per formare AFB, per i corpi PML associati ai telomeri ALT17,18. I telomeri si raggruppano all’interno delle AFB, presumibilmente per fornire modelli di riparazione per la sintesi del DNA telomerico diretto all’omologia in ALT19. Infatti, la sintesi del DNA dei telomeri è stata rilevata nelle AFB e le AFB svolgono un ruolo essenziale nell’arricchire i fattori di riparazione del DNA sui telomeri20,21. Tuttavia, i meccanismi alla base dell’assemblaggio APB e del clustering dei telomeri all’interno delle APB erano sconosciuti. Poiché le proteine dei telomeri nelle cellule ALT sono modificate in modo univoco da piccoli modificatori ubiquitina-simili (SUMO)22, molti componenti APB contengono siti di sumoilazione 22,23,24,25 e / o motivi interagendo SUMO (SIM) 26,27e interazioni SUMO-SIM guidano la separazione di fase28, abbiamo ipotizzato che la sumoilazione sui telomeri porti all’arricchimento di proteine contenenti SUMO / SIM e Le interazioni SUMO-SIM tra queste proteine portano alla separazione di fase. La proteina PML, che ha tre siti di sumoilazione e un sito SIM, può essere reclutata in telomeri sumoilati per formare AFB e la coalescenza delle AMB liquide porta al raggruppamento dei telomeri. Per testare questa ipotesi, abbiamo usato il sistema di dimerizzazione chimica per imitare la formazione di APB indotta dalla sumoilazione reclutando SIM nei telomeri (Figura 2A)11. La GFP viene fusa con Haloenzima per la visualizzazione e con la proteina legante i telomeri TRF1 per ancorare il dimerizzatore ai telomeri. SIM è fusa a eDHFR e mCherry. La cinetica della formazione di condensa e il clustering dei telomeri indotti dalla fusione di goccioline sono seguiti dall’imaging di cellule vive. La separazione di fase viene invertita aggiungendo TMP libero in eccesso per competere con il legame eDHFR. L’immunofluorescenza (IF) e l’ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) vengono utilizzate per determinare la composizione della condensa e l’associazione telomerica. Il reclutamento di SIM arricchisce SUMO sui telomeri e i condensati indotti contengono PML e quindi sono AFB. Il reclutamento di un mutante SIM che non può interagire con SUMO non arricchisce SUMO sui telomeri o induce la separazione di fase, indicando che la forza motrice fondamentale per la condensazione APB è l’interazione SUMO-SIM. Concordando con questa osservazione, i polimeri polySUMO-polySIM che si sono fusi a un fattore di legame TRF2 RAP1 possono anche indurre la formazione di APB29. Rispetto al sistema di fusione polySUMO-polySIM in cui la separazione di fase avviene finché vengono prodotte abbastanza proteine, l’approccio di dimerizzazione chimica qui presentato induce la separazione di fase su richiesta e quindi offre una migliore risoluzione temporale per monitorare la cinetica della separazione di fase e del processo di clustering dei telomeri. Inoltre, questo sistema di dimerizzazione chimica consente il reclutamento di altre proteine per valutare la loro capacità di indurre la separazione di fase e il clustering dei telomeri. Ad esempio, una proteina disordinata reclutata nei telomeri può anche formare goccioline e telomeri a grappolo senza indurre la formazione di APB, suggerendo che il clustering dei telomeri è indipendente dalla chimica APB e si basa solo sulla proprietà liquida APB11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo ha dimostrato la formazione e la dissoluzione di condensati sui telomeri con un sistema di dimerizzazione chimica. La cinetica della separazione di fase e del clustering dei telomeri indotto dalla fusione di goccioline viene monitorata con immagini dal vivo. La localizzazione e la composizione della condensa sono determinate con DNA FISH e proteina IF.
Ci sono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo è determinare la concentrazione di proteine e dimerizzatori. Il …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) e dalla fondazione Charles E. Kaufman a H.Z. Gli autori desiderano ringraziare Jason Tones per aver corretto il manoscritto.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
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