Denne protokol illustrerer et kemisk induceret protein dimerization system til at skabe kondensater på kromatin. Dannelsen af promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ på telomerer med kemisk dimerizers er demonstreret. Dråbevækst, opløsning, lokalisering og sammensætning overvåges med levende cellebilleddannelse, immunofluorescence (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH).
Kromatin-associerede kondensater er impliceret i mange nukleare processer, men de underliggende mekanismer forbliver undvigende. Denne protokol beskriver et kemisk induceret protein dimeriseringssystem til at skabe kondensater på telomerer. Den kemiske dimerizer består af to forbundne ligands, der hver især kan binde sig til et protein: Halo ligand til Halo-enzym og trimethoprim (TMP) til henholdsvis E. coli dihydrofolat reduktase (eDHFR). Fusion af Halo enzym til en telomere protein ankre dimerizers til telomerer gennem kovalent Halo ligand-enzym bindende. Binding af TMP til eDHFR rekrutterer eDHFR-smeltet fase, der adskiller proteiner til telomerer og fremkalder kondensatdannelse. Da TMP-eDHFR interaktion er ikke-kovalent, kan kondens vendes ved hjælp af overskydende gratis TMP til at konkurrere med dimerizeren til eDHFR-binding. Et eksempel på at fremkalde promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ dannelse på telomerer og bestemmelse kondensat vækst, opløsning, lokalisering og sammensætning er vist. Denne metode kan let tilpasses til at fremkalde kondensater på andre genomiske steder ved at smelte Halo til et protein, der direkte binder sig til den lokale kromatin eller til dCas9, der er målrettet mod det genomiske græshoppe med en guide RNA. Ved at tilbyde den tidsmæssige opløsning, der kræves til enkeltcellet levende billeddannelse, samtidig med at faseadskillelsen i en population af celler til biokemiske analyser opretholdes, er denne metode velegnet til sondering af både dannelsen og funktionen af kromatin-associerede kondensater.
Mange proteiner og nukleinsyrer gennemgår væske væske væskefaseadskillelse (LLPS) og samler sig selv i biomolekyllære kondensater for at organisere biokemi i cellerne1,2. LLPS af kromatinbindende proteiner fører til dannelse af kondensater, der er forbundet med specifikke genomiske loci og er impliceret i forskellige lokale kromatinfunktioner3. For eksempel, LLPS af HP1 protein ligger til grund for dannelsen af heterochromatin domæner til at organisere genomet4,5, LLPS af transskription faktorer danner transskription centre til at regulere transskription6, LLPS af spirende mRNAs og multi-sex kamme protein genererer histone locus organer til at regulere transskription og behandling af histone mRNAs7. På trods af mange eksempler på kromatin-associerede kondensater, der opdages, forbliver de underliggende mekanismer for kondensatdannelse, regulering og funktion dårligt forstået. Især dannes ikke alle kromatin-associerede kondensater gennem LLPS , og omhyggelige evalueringer af kondensatdannelse i levende celler er stadig nødvendige8,9. For eksempel er HP1-protein i musen vist sig kun at have en svag evne til at danne flydende dråber i levende celler og heterochromatin foci opfører sig som kollapset polymer globules10. Derfor er værktøjer til at fremkalde de novo kondensater på kromatin i levende celler ønskelige, især dem, der tillader brug af levende billeddannelse og biokemiske analyser til at overvåge kinetikken af kondensatdannelse, de fysiske og kemiske egenskaber af de resulterende kondensater og de cellulære konsekvenser af kondensatdannelse.
Denne protokol rapporterer et kemisk dimeriseringssystem til at fremkalde proteinkondenater på kromatin11 (Figur 1A). Dimerizeren består af to forbundne protein-interagerende ligands: trimethoprim (TMP) og Halo ligand og kan dimerisere proteiner smeltet til cognate receptorer: Escherichia coli dihydrofolat reduktase (eDHFR) og en bakteriel alkyldehalogenase enzym (Halo enzym), henholdsvis12. Samspillet mellem Halo ligand og Halo enzym er kovalent, så Halo enzym kan bruges som anker ved at smelte det til en kromatin-bindende protein til at rekruttere en fase-adskille protein smeltet til eDHFR til kromatin. Efter den første rekruttering passerer den øgede lokale koncentration af den fase, der adskiller protein, den kritiske koncentration, der er nødvendig for faseadskillelse, og nukleter således et kondensat ved ankeret (figur 1B). Ved at sammensmelte fluorescerende proteiner (f.eks. mCherry og eGFP) til eDHFR og Halo kan nukleation og vækst af kondensater visualiseres i realtid med fluorescensmikroskopi. Da samspillet mellem eDHFR og TMP er ikke-kovalent, kan overskydende gratis TMP tilføjes for at konkurrere med dimerizeren til eDHFR-binding. Dette vil derefter frigive faseadskillelsesproteinet fra ankeret og opløse det kromatin-tilknyttede kondensat.
Vi brugte dette værktøj til at fremkalde de novo promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ dannelse på telomerer i telomerase-negative kræftceller, der bruger en alternativ forlængelse af telomerer (ALT) vej til telomere vedligeholdelse13,14. PML nukleare organer er membran-mindre rum involveret i mange nukleare processer15,16 og er entydigt lokaliseret til ALT telomerer til at danne APBs, for ALT telomere-associerede PML organer17,18. Telomerer klynge i APBs, formentlig at give reparation skabeloner til homology-rettet telomere DNA syntese i ALT19. Faktisk telomere DNA syntese er blevet påvist i APBs og APBs spiller afgørende roller i berige DNA reparation faktorer på telomerer20,21. De mekanismer, der lå til grund for APB-samling og telomereklynger i APB’er, var imidlertid ukendte. Da telomereproteiner i ALT-celler er unikt modificeret af små allestedsnærværende-lignende modifikator (SUMOs)22, indeholder mange APB-komponenter sumoylationssteder 22,23,24,25 og / eller SUMO-interagerende motiver (SIMMs)26,27 og SUMO-SIM-interaktioner driver faseadskillelse28, vi hypotese, at sumoylation på telomerer fører til berigelse af SUMO / SIM indeholdende proteiner og SUMO-SIM interaktioner mellem disse proteiner fører til faseadskillelse. PML protein, som har tre sumoylation steder og en SIM-site, kan rekrutteres til sumoylated telomerer til at danne APBs og sammensmeltning af flydende APBs fører til telomerer klyngedannelse. For at teste denne hypotese brugte vi det kemiske dimeriseringssystem til at efterligne sumoylationsinduceret APB-formation ved at rekruttere SIM til telomerer (Figur 2A)11. GFP er smeltet sammen til Haloenzym til visualisering og til telomerebindende protein TRF1 for at forankre dimerizeren til telomerer. SIM er smeltet til eDHFR og mCherry. Kinetik af kondensatdannelse og dråbefusionsinduceret telomereklynger følges med levende cellebilleddannelse. Faseadskillelse vendes ved at tilføje overskydende gratis TMP for at konkurrere med eDHFR-binding. Immunfluorescence (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH) anvendes til at bestemme kondensatsammensætning og telomerisk forening. Rekruttering af SIM beriger SUMO på telomerer, og de inducerede kondensater indeholder PML og er derfor APB’er. Rekruttering af en SIM mutant, der ikke kan interagere med SUMO ikke berige SUMO på telomerer eller fremkalde fase adskillelse, hvilket indikerer, at den grundlæggende drivkraft for APB kondens er SUMO-SIM interaktion. Enig med denne observation, polySUMO-polySIM polymerer, der smeltede til en TRF2 bindende faktor RAP1 kan også fremkalde APB dannelse29. Sammenlignet med polySUMO-polySIM fusionssystemet, hvor faseadskillelse forekommer, så længe der produceres nok proteiner, fremkalder den kemiske dimeriseringsmetode, der præsenteres her, faseadskillelse efter behov og giver dermed bedre tidsmæssig opløsning til at overvåge kinetik af faseadskillelse og telomereklyngningsproces. Derudover tillader dette kemiske dimeriseringssystem rekruttering af andre proteiner til at vurdere deres evne til at fremkalde faseadskillelse og telomereklynger. For eksempel kan et uordnet protein rekrutteret til telomerer også danne dråber og klynge telomerer uden at fremkalde APB dannelse, hvilket tyder telomere klyngedannelse er uafhængig af APB kemi og kun er afhængig af APB flydende ejendom11.
Denne protokol demonstrerede dannelse og opløsning af kondensater på telomerer med et kemisk dimeriseringssystem. Kinetik af faseadskillelse og dråbefusionsinduceret telomereklynger overvåges med levende billeddannelse. Kondensat lokalisering og sammensætning bestemmes med DNA FISH og protein IF.
Der er to vigtige trin i denne protokol. Den første er at bestemme protein og dimerizer koncentration. Succesen med at fremkalde lokal faseadskillelse ved et genomisk græshoppe afhænger af sti…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health (1K22CA23763201 til H.Z., GM118510 til D.M.C.) og Charles E. Kaufman foundation til H.Z. Forfatterne vil gerne takke Jason Tones for korrekturlæsning af manuskriptet.
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
Pipet Tips | VWR | 10017 | |
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |