تصور وقياس الأضرار التي لحقت بالحمض النووي الخاصة بالموقع القائم على الإندونوكليز
Summary
تقدم هذه المقالة الخطوات الأساسية لتثبيط المناعة والكروماتين المناعي. وتستخدم هذه البروتوكولات عادة لدراسة العمليات الخلوية المرتبطة بتلف الحمض النووي ولتصور وقياس تجنيد البروتينات المتورطة في إصلاح الحمض النووي.
Abstract
تتعرض الخلايا باستمرار لمختلف العوامل الضارة بالحمض النووي، مما يؤدي إلى استجابات خلوية مختلفة. تطبيق النهج الكيميائية الحيوية والجينية أمر ضروري في الكشف عن الأحداث الخلوية المرتبطة بتوظيف وتجميع مجمعات إصلاح الحمض النووي في موقع تلف الحمض النووي. في السنوات القليلة الماضية، تم تطوير العديد من الأدوات القوية للحث على تلف الحمض النووي الخاص بالموقع. وعلاوة على ذلك، تسمح لنا التقنيات الأساسية الجديدة بدراسة هذه العمليات على مستوى دقة الخلية الواحدة باستخدام الخلايا الثابتة والحية على حد سواء. على الرغم من أن هذه التقنيات قد استخدمت لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة، وهنا نقدم البروتوكولات الأكثر استخداما في مجال إصلاح الحمض النووي، والتأني المناعي الفلوري (IF) وChromatin Immunoprecipitation (ChIP)، والتي في تركيبة مع تلف الحمض النووي الموقع القائم على الإنتونوكليز تجعل من الممكن تصور وقياس الإشغال الجينومي لعوامل إصلاح الحمض النووي بطريقة موجهة ومنظمة، على التوالي. توفر هذه التقنيات أدوات قوية للباحثين لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة بالجراد الجينومي التالف بالإضافة إلى تعديلاتها اللاحقة للترجمة اللازمة لتنظيمها الدقيق أثناء إصلاح الحمض النووي.
Introduction
الجينوم لدينا هو باستمرار تواجه تحديا من قبل مختلف العوامل الضارة الحمض النووي. ويمكن أن تستمد هذه الاعتداءات من مصادر بيئية، مثل الأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع، وكذلك من مصادر داخلية، مثل المنتجات الثانوية الأيضية الناجمة عن الإجهاد التأكسدي أو أخطاء النسخ المتماثل1،2. يمكن أن تؤثر هذه الآفات على سلامة أحد أو كل من خيوط الحمض النووي ، وإذا أصبحت الأخطاء المتولدة مستمرة ، فإنها تؤدي في كثير من الأحيان إلى عمليات النقل وعدم استقرار الجينوم ، مما قد يؤدي إلى تكوين الورم3،4. للحفاظ على سلامة الجينوم، تم تطوير أنظمة إصلاح متعددة أثناء التطور. وفقا للخصائص الكيميائية والفيزيائية لأنواع محددة من تلف الحمض النووي ، يمكن تنشيط آليات إصلاح متعددة. عدم التطابق، والمواقع abasic، فواصل حبلا واحد، و 8-oxoguanine (8-oxoG) يمكن إزالتها إما عن طريق إصلاح عدم التطابق أو قاعدة الختان إصلاح المسار5،6. الآفات الناجمة عن المنتجات الضوئية الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية والإضافات الضخمة يمكن إصلاحها إما عن طريق إصلاح النيوكليوتيدات الختان (NER) أو إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج حبلا (DSBR) عملية7،8. يتكون NER من مسارين فرعيين رئيسيين: NER المقترن بالنص (TC-NER) وNER الجينوم العالمي (GG-NER). فيما يتعلق بمرحلة دورة الخلية، بعد التعريفي كسر حبلا مزدوجة الحمض النووي، يمكن تنشيط مسارين فرعيين: غير متجانسة نهاية الانضمام (NHEJ) وإعادة التركيب متجانسة (HR)1،9. يمكن تنشيط NHEJ ، وهو المسار المهيمن في الخلايا يستريح ، في جميع مراحل دورة الخلية ، مما يمثل مسارا أسرع ولكن عرضة للخطأ10. من ناحية أخرى، الموارد البشرية هو مسار خالية من الأخطاء، والتي يتم إصلاح DSBs على أساس البحث تسلسل التماثل من الكروماتيدات الشقيقة، وبالتالي فهو موجود أساسا في مراحل دورة الخلية S و G211. وعلاوة على ذلك، فإن الانضمام إلى نهاية الميكروهوميكولوجيا بوساطة (MMEJ) هو آلية إصلاح أخرى ل DSB، تختلف عن تلك المذكورة أعلاه، استنادا إلى طريقة KU70/80-وRAD51 المستقلة لإعادة ربط تسلسلات microhomologous التي تم استئصالها سابقا والتي تحيط بنهايات الحمض النووي المكسورة. لذلك، يعتبر MMEJ أن تكون عرضة للخطأ ومطفرة للغاية12. أثناء إصلاح الحمض النووي، DSBs يمكن أن تحفز استجابة تلف الحمض النووي (DDR)، مما يؤدي إلى تفعيل kinases نقطة التفتيش التي توقف دورة الخلية أثناء إصلاح13،14،15. يتم تنشيط DDR كرد فعل على التوظيف والانتشار الواسع النطاق للاعبين الرئيسيين البادئين في عملية الإصلاح حول الآفات ، مما يساهم في تشكيل تركيز الإصلاح. في هذه السلسلة الإشارات المبكرة، وM ATM (Ataxia Telangiectasia تحور) كيناز يلعب دورا محوريا من خلال تحفيز الفوسفور من البديل الهستون H2AX في Ser139 (يشار إليها باسم γH2AX) حول الآفة16. هذا الحدث المبكر هو المسؤول عن توظيف عوامل إصلاح إضافية وبدء عمليات الإصلاح المصب. على الرغم من أن الوظيفة الدقيقة للبروتينات المجندة في محور الإصلاح لم يتم توصيفها بالكامل بعد ، فقد تم التحقيق في تشكيل وديناميات بؤر الإصلاح من قبل العديد من المختبرات. وتستخدم هذه العلامات على نطاق واسع لمتابعة الحركية إصلاح، ولكن دورها الدقيق خلال عملية الإصلاح لا يزال بعيد المنال. نظرا للأهمية الكبيرة ولكن سوء فهم العمليات الخلوية ذات الصلة إصلاح الحمض النووي، وقد وضعت عدة طرق حتى الآن للحث وتصور DDR.
وقد تم إنشاء أساليب ونظم مختلفة للحث على النوع المطلوب من تلف الحمض النووي. على سبيل المثال، بعض العوامل [مثل نيوكارزينوستاتين (NCS)، phleomycin، bleomycin، γ الإشعاع، الأشعة فوق البنفسجية] يمكن أن تحفز أعدادا كبيرة من فواصل الحمض النووي العشوائي في المواقف الجينومية غير التنبؤية، في حين أن الآخرين (endonucleases، مثل AsiSI، I-PpoI أو I-SceI، فضلا عن شريط الليزر) يمكن أن تحفز فواصل الحمض النووي في loci الجينوم المعروفة17،18،19،20،21. هنا، ونحن نركز على التقنيات القائمة على الإندونوكليز المستخدمة حاليا لدراسة DDR في الثدييات وخلايا الخميرة. وبصرف النظر عن تسليط الضوء على مبادئ هذه التقنيات، ونحن نؤكد على كل من مزاياها وعيوبها.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن إصلاح الحمض النووي هو مجال بحثي حديث نسبيا ، إلا أن معرفتنا تتوسع بسرعة بمساعدة طرق كيميائية حيوية ومجههرية مختلفة. الحفاظ على المعلومات الوراثية أمر بالغ الأهمية للخلايا لأن الطفرات التي تحدث في الجينات المشاركة في عمليات الإصلاح هي من بين الأسباب الرئيسية لنشأة الورم وب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل منحة المكتب الوطني للبحوث والتطوير والابتكار GINOP-2.3.2-15-2016-00020، GINOP-2.3.2-15-2016-00036، GINOP-2.2.1-15-2017-00052، EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009، NKFI-FK 132080، منحة أبحاث يانوس بولياي التابعة للأكاديمية المجرية للعلوم BO/27/20، ÚNKP-20-5-SZTE-265، زمالة إمبو قصيرة الأجل 8513، ومؤسسة تيمبوس.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
References
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
- Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
- Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
- Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the ‘end’, it’s a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
- Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
- Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
- Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
- Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
- Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
- Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
- Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
- Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
- Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein–DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).
