Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio
Summary
Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.
Abstract
Las células se exponen continuamente a diversos agentes perjudiciales del ADN, induciendo diferentes respuestas celulares. La aplicación de enfoques bioquímicos y genéticos es esencial para revelar eventos celulares asociados con el reclutamiento y el ensamblaje de complejos de reparación del ADN en el sitio del daño del ADN. En los últimos años, se han desarrollado varias herramientas poderosas para inducir daños en el ADN específicos del sitio. Además, las nuevas técnicas seminales nos permiten estudiar estos procesos a nivel de resolución unicelular utilizando células fijas y vivas. Aunque estas técnicas se han utilizado para estudiar diversos procesos biológicos, aquí presentamos los protocolos más ampliamente utilizados en el campo de la reparación del ADN, inmunotinción por fluorescencia (IF) e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que en combinación con el daño del ADN específico del sitio basado en endonucleasa permiten visualizar y cuantificar la ocupación genómica de los factores de reparación del ADN de una manera dirigida y regulada, respectivamente. Estas técnicas proporcionan herramientas poderosas para que los investigadores identifiquen nuevas proteínas unidas al locus genómico dañado, así como sus modificaciones postraduccionales necesarias para su regulación de ajuste fino durante la reparación del ADN.
Introduction
Nuestro genoma está siendo constantemente desafiado por varios agentes dañinos del ADN. Estos ataques pueden derivar de fuentes ambientales, como la luz UV o la irradiación, así como de fuentes endógenas, como subproductos metabólicos causados por estrés oxidativo o errores de replicación1,2. Estas lesiones pueden afectar la integridad de una o ambas cadenas de ADN, y si los errores generados se vuelven persistentes, con frecuencia conduce a translocaciones e inestabilidad del genoma, lo que puede resultar en tumorigénesis3,4. Para mantener la integridad del genoma, se han desarrollado múltiples sistemas de reparación durante la evolución. De acuerdo con las propiedades químicas y físicas de tipos específicos de daño en el ADN, se pueden activar múltiples mecanismos de reparación. Los desajustes, los sitios abásicos, las roturas de una sola cadena y la 8-oxoguanina (8-oxoG) se pueden eliminar mediante la reparación de desajuste o la vía de reparación de escisión de bases5,6. Las lesiones causadas por fotoproductos inducidos por uv y aductos voluminosos pueden ser reparados ya sea por reparación de nucleótido-escisión (NER) o reparación de rotura de doble cadena de ADN (DSBR) proceso7,8. NER consiste en dos sub-vías principales: NER acoplado a transcripción (TC-NER) y NER genómico global (GG-NER). En cuanto a la fase del ciclo celular, tras la inducción de ruptura de doble cadena del ADN, se pueden activar dos sub-vías: unión final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR)1,9. Nhej, que es la vía dominante en las células en reposo, se puede activar en todas las fases del ciclo celular, lo que representa una vía más rápida pero propensa aerrores 10. Por otro lado, la FC es una vía libre de errores, en la que los DSBs se reparan en base a la búsqueda de secuencia-homología de las cromátidas hermanas, por lo que está presente principalmente en las fases11del ciclo celular S y G2. Además, la unión final mediada por microhomología (MMEJ) es otro mecanismo de reparación DSB, distinto de los ya mencionados, basado en una forma independiente de KU70/80 y RAD51 de re-ligadura de secuencias microhomólogas previamente resecadas flanqueando los extremos de ADN rotos. Por lo tanto, se considera que mmej es propenso a errores y altamente mutagénico12. Durante la reparación del ADN, los DSB pueden inducir la respuesta de daño al ADN (DDR), lo que resulta en la activación de quinasas de punto de control que detienen el ciclo celular durante la reparación13,14,15. El DDR se activa como respuesta al reclutamiento y la difusión extensa de los jugadores dominantes del iniciador del proceso de la reparación alrededor de las lesiones, contribuyendo a la formación de un foco de la reparación. En esta cascada de señalización temprana, la quinasa ATM (Ataxia Telangiectasia Mutada) juega un papel fundamental al catalizar la fosforilación de la variante de histonas H2AX en Ser139 (denominada γH2AX) alrededor de la lesión16. Este evento temprano es responsable de la contratación de factores de reparación adicionales y el inicio de los procesos de reparación aguas abajo. Aunque la función exacta de las proteínas reclutadas en el foco de la reparación todavía no se haya caracterizado completamente, la formación y la dinámica de los focos de la reparación han sido investigadas por varios laboratorios. Estos marcadores se utilizan ampliamente para seguir la cinética de reparación, pero su papel preciso durante el proceso de reparación sigue siendo difícil de alcanzar. Debido a la gran importancia pero la comprensión pobre de los procesos celulares reparación-relacionados de la DNA, varios métodos se han desarrollado hasta ahora para inducir y para visualizar el DDR.
Se han establecido varios métodos y sistemas para inducir el tipo deseado de daño en el ADN. Por ejemplo, algunos agentes [como la neocarzinostatina (NCS), la fleomicina, la bleomicina, la γ-irradiación, los rayos UV] pueden inducir un gran número de roturas aleatorias del ADN en posiciones genómicas no predictivas, mientras que otros (endonucleasas, como AsiSI, I-PpoI o I-SceI, así como el rayado láser) pueden inducir roturas de ADN en loci genómicos conocidos17,18,19,20,21. Aquí, nos centramos en las técnicas basadas en endonucleasas utilizadas actualmente para estudiar el DDR en células de mamíferos y levaduras. Aparte de destacar los principios de estas técnicas, hacemos hincapié tanto en sus ventajas como en sus desventajas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque la reparación de la DNA sea un campo de investigación relativamente reciente, nuestro conocimiento se está ampliando rápidamente con la ayuda de varios métodos bioquímicos y microscópicos. Preservar la información genética es crucial para las células, ya que las mutaciones que ocurren en los genes involucrados en los procesos de reparación se encuentran entre las principales causas de tumorigénesis y, por lo tanto, es esencial dilucidar los pasos clave de las vías de reparación del ADN.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por la subvención de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, la Beca de Investigación János Bolyai de la Academia Húngara de Ciencias BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, la beca de corta duración EMBO 8513 y la Fundación Tempus.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
References
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
- Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
- Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
- Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the ‘end’, it’s a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
- Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
- Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
- Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
- Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
- Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
- Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
- Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
- Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
- Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein–DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).
