Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi
Summary
Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.
Abstract
Le cellule sono continuamente esposte a vari agenti dannosi per il DNA, inducendo diverse risposte cellulari. L’applicazione di approcci biochimici e genetici è essenziale per rivelare eventi cellulari associati al reclutamento e all’assemblaggio di complessi di riparazione del DNA nel sito di danni al DNA. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati diversi potenti strumenti per indurre danni al DNA specifici del sito. Inoltre, le nuove tecniche seminali ci permettono di studiare questi processi a livello di risoluzione a cella singola utilizzando cellule fisse e viventi. Sebbene queste tecniche siano state utilizzate per studiare vari processi biologici, qui presentiamo i protocolli più utilizzati nel campo della riparazione del DNA, dell’immunosomodulazione della fluorescenza (IF) e dell’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), che in combinazione con danni al DNA site-specific basati sull’endonucleasi rendono possibile visualizzare e quantificare l’occupazione genomica dei fattori di riparazione del DNA in modo diretto e regolamentato, rispettivamente. Queste tecniche forniscono potenti strumenti per i ricercatori per identificare nuove proteine legate al locus genomico danneggiato e le loro modifiche post-tras traslazione necessarie per la loro regolazione accurata durante la riparazione del DNA.
Introduction
Il nostro genoma è costantemente sfidato da vari agenti dannosi per il DNA. Questi assalti possono derivare da fonti ambientali, come la luce UV o l’irradiazione, nonché da fonti endogene, come i prodotti chimici metabolici causati da stress ossidativo o errori direplicazione 1,2. Queste lesioni possono influenzare l’integrità di uno o entrambi i filamenti di DNA e, se gli errori generati diventano persistenti, spesso porta a traslocazioni e instabilità del genoma, che possono causare tumorigenesi3,4. Per mantenere l’integrità del genoma, sono stati sviluppati più sistemi di riparazione durante l’evoluzione. In base alle proprietà chimiche e fisiche di specifici tipi di danni al DNA, è possibile attivare più meccanismi di riparazione. Disallineamenti, siti di base, rotture a singolo filamento e 8-ossoguanina (8-ossoG) possono essere rimossi sia per riparazione disallineamento che per via di riparazione dell’escissione di base5,6. Le lesioni causate da fotoprodotti indotti dai raggi UV e da addotti ingombranti possono essere riparate sia mediante riparazione nucleotidiche-escissione (NER) che con il processo di riparazione della rottura a doppio filamento del DNA (DSBR)7,8. Il NER è costituito da due sotto pathway principali: NER accoppiato alla trascrizione (TC-NER) e NER genomico globale (GG-NER). Per quanto riguarda la fase del ciclo cellulare, a seguito dell’induzione della rottura del doppio filamento del DNA, possono essere attivate due sottopercorsi: l’unione finale non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR)1,9. NHEJ, che è la via dominante nelle cellule a riposo, può essere attivato in tutte le fasi del ciclo cellulare, rappresentando una via più veloce ma soggetta a errori10. D’altra parte, l’HR è un percorso privo di errori, in cui i DSB vengono riparati in base alla ricerca sequenza-omologia dei cromatidi sorelle, quindi è presente principalmente nelle fasi del ciclo cellulare S e G211. Inoltre, l’unione finale mediata dalla microomologia (MMEJ) è un altro meccanismo di riparazione DSB, distinto da quelli sopra menzionati, basato su un modo indipendente da KU70/80 e RAD51 di ri-legatura di sequenze microomologhe precedentemente resettate che fiancheggiano le estremità del DNA rotte. Pertanto, MMEJ è considerato soggetto a errori e altamente mutageno12. Durante la riparazione del DNA, i DSB possono indurre la risposta al danno al DNA (DDR), che si traduce nell’attivazione di chinasi del checkpoint che interrovono il ciclocellulare durante la riparazione 13,14,15. Il DDR viene attivato come risposta al reclutamento e all’ampia diffusione di attori chiave iniziatori del processo di riparazione intorno alle lesioni, contribuendo alla formazione di un focus di riparazione. In questa prima cascata di segnalazione, la chinasi ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) gioca un ruolo fondamentale analizzando la fosforilazione della variante istonica H2AX a Ser139 (indicata come γH2AX) intorno alla lesione16. Questo primo evento è responsabile dell’assunzione di ulteriori fattori di riparazione e dell’avvio dei processi di riparazione a valle. Sebbene l’esatta funzione delle proteine reclutate al centro di riparazione non sia stata ancora completamente caratterizzata, la formazione e la dinamica dei focolai di riparazione sono state studiate da diversi laboratori. Questi marcatori sono ampiamente utilizzati per seguire la cinetica di riparazione, ma il loro ruolo preciso durante il processo di riparazione rimane sfuggente. A causa della grande importanza ma scarsa comprensione dei processi cellulari legati alla riparazione del DNA, sono stati sviluppati diversi metodi finora per indurre e visualizzare il DDR.
Sono stati stabiliti vari metodi e sistemi per indurre il tipo desiderato di danno al DNA. Ad esempio, alcuni agenti [come la neocarzinostatina (NCS), la fleomicina, la bleomicina, l’irradiazione γ, UV] può indurre un gran numero di rotture casuali del DNA in posizioni genomiche non predittive, mentre altre (endonucleasi, come AsiSI, I-PpoI o I-SceI, così come lo striping laser) possono indurre rotture di DNA a loci genomicinoti 17,18,19,20,21. Qui, ci concentriamo sulle tecniche a base di endonucleasi attualmente utilizzate per studiare il DDR nelle cellule di mammiferi e lieviti. Oltre a sottolineare i principi di queste tecniche, sottolineiamo sia i loro vantaggi che svantaggi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene la riparazione del DNA sia un campo di ricerca relativamente recente, le nostre conoscenze si stanno rapidamente espandendo con l’aiuto di vari metodi biochimici e microscopici. Preservare le informazioni genetiche è fondamentale per le cellule poiché le mutazioni che si verificano nei geni coinvolti nei processi di riparazione sono tra le principali cause di tumorigenesi e quindi è essenziale chiarire le fasi chiave delle vie di riparazione del DNA.
Le tecniche biochimiche (ad esem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dall’Ufficio Nazionale Ricerca, Sviluppo e Innovazione che ha concesso a GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, la borsa di studio János Bolyai Research dell’Accademia ungherese delle scienze BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, la borsa di studio a breve termine EMBO 8513 e la Fondazione Tempus.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
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