We beschrijven methoden om TGF-β2-geïnduceerde EndMT in endotheelcellen te onderzoeken door celmorfologieveranderingen te observeren en de expressie EndMT-gerelateerde markerveranderingen te onderzoeken met behulp van immunofluorescentiekleuring. CRISPR/Cas9 genbewerking werd beschreven en gebruikt om het gen dat codeert voor Snail uit te putten om zijn rol in TGF-β2-geïnduceerde EndMT te onderzoeken.
Als reactie op specifieke externe signalen en de activering van bepaalde transcriptiefactoren, kunnen endotheelcellen differentiëren in een mesenchymal-achtig fenotype, een proces dat endotheel wordt genoemd voor mesenchymale overgang (EndMT). Nieuwe resultaten hebben gesuggereerd dat EndMT oorzakelijk verband houdt met meerdere menselijke ziekten, zoals fibrose en kanker. Bovendien kunnen endotheliale mesenchymale cellen worden toegepast in weefselregeneratieprocedures, omdat ze verder kunnen worden onderscheiden in verschillende celtypen (bijv. osteoblasten en chondrocyten). De selectieve manipulatie van EndMT kan dus klinisch potentieel hebben. Net als epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT), kan EndMT sterk worden geïnduceerd door de uitgescheiden cytokine transformerende groeifactor-bèta (TGF-β), die de expressie van zogenaamde EndMT transcriptiefactoren (EndMT-TFs), waaronder Snail and Slug, stimuleert. Deze EndMT-TF’s vervolgens omhoog- en omlaagreguleren de niveaus van respectievelijk mesenchymale en endotheeleiwitten. Hier beschrijven we methoden om TGF-β-geïnduceerde EndMT in vitro te onderzoeken, inclusief een protocol om de rol van bepaalde TF’s in TGF-β-geïnduceerde EndMT te bestuderen. Met behulp van deze technieken leveren we bewijs dat TGF-β2 EndMT stimuleert in muriene pancreasmicrovasculaire endotheelcellen (MS-1-cellen), en dat de genetische uitputting van Snail met behulp van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR)/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9)-gemedieerde genbewerking dit fenomeen in de weg staat. Deze aanpak kan dienen als een model om potentiële modulatoren van endotheelbiologie te ondervragen en kan worden gebruikt om genetische of farmacologische schermen uit te voeren om nieuwe regulatoren van EndMT te identificeren, met mogelijke toepassing bij menselijke ziekten.
Endotheel voor mesenchymale overgang (EndMT) is een multistep en dynamisch biologisch fenomeen dat is gekoppeld aan diverse fysiologische en pathologische processen1,2. Bij EndMT verliezen endotheelcellen geleidelijk hun endotheeleigenschappen, terwijl ze mesenchymale eigenschappen verwerven3; zo differentiëren strak verdichte en goed georganiseerde endotheelcellen zich in langwerpige mesenchymale cellen. Morfologische veranderingen in EndMT vallen samen met veranderingen in de expressie van bepaalde genen en eiwitten. Over het algemeen neemt de expressie van eiwitten die endotheelkenmerken behouden, waaronder vasculaire endotheel (VE)-cadherine, bloedplaatjes/EC adhesiemolecuul-1 (CD31/Pecam-1) af. Tegelijkertijd accumuleren eiwitten gerelateerd aan mesenchymale functies, zoals α-gladde spier actine (α-Sma) en gladde spiereiwit 22α (Sm22α). Nieuwe resultaten hebben aangetoond dat postnatale EndMT bijdraagt aan de ontwikkeling van menselijke ziekten, zoals kanker, hartfibrose, pulmonale arteriële hypertensie (PAH), atherosclerose(AS), orgaanfibrose,enz. Een dieper begrip van de onderliggende mechanismen van EndMT en hoe het EndMT-proces te sturen, zal nieuwe therapeutische methoden bieden voor EndMT-gerelateerde ziekten en regeneratieve geneeskunde.
TGF-β is een van de belangrijkste EndMT-inductoren, en andere bekende betrokken factoren zijn Wnt/β-catenine, Notch en sommige inflammatoire cytokines1. Aangezien de cellulaire context van cruciaal belang is voor reacties die worden geactiveerd door TGF-β, is het samenspel van TGF-β met andere EndMT-bevorderingssignalen relevant voor TGF-β om een EndMT-respons op te wekken. Bij de activering van TGF-β celoppervlak type I en type II serine/threonine kinase receptoren wordt de intracellulaire canonieke Smad-route geactiveerd. TGF-β receptorgemedieerde gefosforyleerde Smad2/3 vormen heteromere complexen met Smad4 die in de kern worden overgetranslogeerd, waar ze de expressie van EndMT-gerelateerde transcriptiefactoren upreguleren. Net als bij epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT) worden transcriptiefactoren zoals Snail, Slug, Twist, Zeb1 en Zeb2 geïnduceerd door TGF-β signalering en dragen bij aan genherprogrammering in EndMT8.
Slak is vaak geïdentificeerd als een belangrijke factor in EndMT. Slak bindt zich aan de promotor van genen die coderen voor celceladhesie-eiwitten en onderdrukt hun transcriptie, wat wordt gecompenseerd door de verbetering van de expressie van mesenchymale eiwitten9. Endotheelcellen vormen een zeer heterogene populatie en de relatieve invloed van diverse extracellulaire stimuli op EndMT kan verschillen tussen endotheel cellulaire contexten of celtypen10. Vanwege de overeenkomsten met EMT zijn sommige methodologieën nuttig om beide mechanismen EMT en EndMT8te onderzoeken . In dit verband benadrukt de EMT International Association (TEMTIA) sterk de noodzaak van aanvullende technieken om uiteindelijk het optreden van EMT/EndMT11aan te tonen .
Hier beschrijven we een methode om het TGF-β-geïnduceerde EndMT-proces te monitoren en te visualiseren. Immunofluorescentiekleuring biedt de basisinformatie over expressieveranderingen in gerichte eiwitten/markers, die worden gebruikt als indicatoren voor de vraag of het EndMT-proces plaatsvindt. Bovendien kan de immunofluorescentiekleuring de lokalisatie van eiwitten/ markers en celmorfologie visualiseren. Om de potentiële activiteit van specifieke TF’s (of andere upstream- of downstreamregulatoren) die betrokken zijn bij TGF-β gemedieerde EndMT te bestuderen, beschrijven we een protocol met behulp van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeats (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde eiwit 9 (Cas9) genbewerking om specifieke genen uit cellen uit te putten, met behulp van de TF Snail als voorbeeld. Cas9 is een dual RNA-geleide DNA-endonuclease die sequenties herkent en splijt die complementair zijn aan CRISPR-sequenties in bacteriën12. Het CRISPR/Cas9-systeem wordt momenteel veel gebruikt omdat het genetische manipulatie in vitro en in vivo13vergemakkelijkt. Geleid door een enkele gids RNA (sgRNA), ectopisch uitgedrukt Cas9 genereert een dubbele streng break op een vooraf geselecteerde targeting volgorde in een specifieke gen locus. Niet-homologe eindvoeging (NHEJ) vindt plaats om cas9-geïnduceerde strengbreuken te repareren, via willekeurige nucleotide-inserties of deleties, wat leidt tot de verstoring en inactivatie van het beoogde gen. We beschrijven in detail methoden voor het ontwerpen van selectieve sgRNAs en het genereren van lentiviral-compatibele vectoren die de ontworpen sgRNAs bevatten. Als gevolg hiervan kunnen stabiele genarmde endotheelcellen op een efficiënte en betrouwbare manier worden gegenereerd.
In deze studie gebruikten we muriene pancreasmicrovasculaire endotheelcellen (MS-1)14 als modelsysteem om het TGF-β2-geïnduceerde EndMT-proces te onderzoeken. Onze vorige studie toonde aan dat Snail de belangrijkste transcriptiefactor is verhoogd met TGF-β2, waardoor EndMT wordt geïnduceerd in MS-1 cellen15. Bij CRISPR/Cas9 genbewerking om de slakkenexpressie in MS-1-cellen af te spoelen, slaagde TGF-β2 er niet in om EndMT te bemiddelen. Deze workflow kan worden toegepast om andere (vermoedelijke) EndMT-gerelateerde genen te bestuderen.
Het begrijpen van het mechanisme van EndMT is van cruciaal belang voor het moduleren van dit proces en het richten op EndMT-gerelateerde ziekten. Hier beschreven we methoden om een TGF-β-geïnduceerde EndMT-test uit te voeren en de rol van de EndMT-TF-slak in TGF-β-geactiveerde EndMT te ondervragen, door CRISPR / Cas9-gemedieerde stabiele gendepletie van Snail uit cellen uit te voeren. De uitputting van slak met behulp van CRISPR/Cas9 aanpak met succes ingebroken TGF-β2 aangedreven EndMT in MS-1 cellen (Figuur 3C). Om de effecten van cytokinen, zoals TGF-β, op EndMT te bestuderen, werden EC’s blootgesteld aan cytokinen en vervolgens werd het optreden van EndMT beoordeeld op basis van morfologische veranderingen en endotheel- en mesenchymale markerexpressieveranderingen in cellen. TGF-β2 sterk geïnduceerde EndMT in MS-1 cellen vergezeld van een sterke toename van de expressie van de transcriptiefactor Snail. De EndMT-TF’s geïnduceerd door TGF-β kunnen verschillen afhankelijk van de soort of weefselspecifiek endotheelceltype. We merkten bijvoorbeeld op dat Snail but not Slug significant werd geherreguleerd door TGF-β in MS-1-cellen, terwijl in menselijke navelstreng endotheelcellen (HUVECs), zowel Snail als Slug worden verhoogd na blootstelling aan TGF-β20.
We hebben de omvang van het EndMT-proces op twee manieren beoordeeld door celmorfologiewijzigingen te onderzoeken en vervolgens door veranderingen in endMT-gerelateerde markersexpressie te onderzoeken. Na blootstelling aan TGF-β gedurende 3 dagen ondergingen cellen EndMT met consistente morfologische variaties en veranderingen in de expressie van EndMT-gerelateerde markers. Naast de immunofluorescentiekleuring die we hier hebben uitgevoerd, kunnen markervariaties ook worden gecontroleerd door western blotting op het eiwitexpressieniveau of door qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR) op de genniveaus21. Naast deze twee tijd- en kostenbesparende methoden die we in dit protocol hebben laten zien, zijn er andere methoden om EndMT te onderzoeken. Het uitvoeren van transcriptoomanalyse (door RNA-sequencing of qPCR) om bijvoorbeeld de expressieniveaus van endotheel- en mesenchymale-gerelateerde genen tussen behandelde en controlecellen tevergelijken,kan EndMT22,23nauwkeurig beoordelen . Bovendien houdt EndMT vaak het stabiele verlies van barrièrefunctie in, dat kan worden beoordeeld door impedantiespectroscopie24. Bovendien kan aanvullend bewijs van de verwerving van stamcelachtige eigenschappen door endmt-afgeleide cellen worden onderzocht. Onder specifieke kweekomstandigheden kunnen EndMT mesenchymale cellen bijvoorbeeld verder worden gedifferentieerd in osteoblasten, chondrocyten, adipocyten of (myo)fibroblasten. Daarom is aanvullende analyse om de differentiatie in verschillende celtypen die tot de mesoderm-afstamming behoren (d.w.z. genexpressie en matrixkleuring) te bevestigen nuttig om de multipotente aard van endMT-afgeleide cellen aan te tonen. Ten slotte zijn de EndMT-beoordelingsmethoden niet beperkt tot in vitro studies, maar kunnen ze worden geëxtrapoleerd om de relatie tussen EndMT en sommige ziekten in vivo of in ex vivo organen te onderzoeken. In die zin wordt het gebruik van endotheelspecifieke afstammingstraceringsstrategieën in grote lijnen uitgebreid tot EndMT-gerelateerd onderzoek25.
Om de rol van Snail tijdens EndMT te onderzoeken, werd in deze studie CRISPR/Cas9 genbewerking gebruikt om dit gen uit te schakelen. De gegevens toonden aan dat TGF-β2 er niet in slaagde om EndMT te bemiddelen in Slakkendeficiënte MS-1 cellen. Deze observatie toonde aan dat Snail essentieel is voor TGF-β2 geïnduceerde EndMT in MS-1 cellen. We gebruikten een onafhankelijke U6-aangedreven sgRNA-expressiecassette om specifieke sgRNAs voor Cas9 te introduceren om Snail te targeten. Naast deze methode beschreven Ran et al.26 een andere strategie voor het klonen van de sgRNA oligos-sequentie in de Cas9-steiger om een constructie te genereren die zowel Cas9- als gRNAs bevat. Opkomende nieuwe benaderingen maken het mogelijk dat CRISPR/Cas extra functies bevat. Dubbele of drievoudige knock-outs kunnen bijvoorbeeld worden bereikt door meer sgRNAs te leveren in cellen die Cas927uitdrukken. Het ontworpen Cas13-eiwit richt zich op en verteert RNA-moleculen zonder endogene DNA28te verstoren. Naast het uitschakelen van genen met CRISPR/Cas, kunnen korte haarspeldbochten (shRNAs) worden gebruikt als alternatieven om gerichte genexpressie stabiel neer te halen29. Voor alle CRISPR/Cas genbewerkingsmethoden moet altijd rekening worden gehouden met off-target decolleté. Bovendien zwijgen kleine interfererende RNA’s (siRNAs) tijdelijk de genexpressie en wordt de siRNA-concentratie verdund met celdeling30. Beide methoden onderdrukken gedeeltelijk gerichte genexpressie. Ectopische genexpressie wordt daarentegen ook gebruikt om de genfunctie te verifiëren tijdens EndMT/EMT31. Deze aanpak kan bepalen of de upregulatie van een gen voldoende is om een EndMT-respons uit te lokken. Daarom zijn er momenteel een groot aantal technische strategieën die kunnen worden gebruikt om potentiële regelgevers van EndMT te identificeren en te verifiëren. Bovendien kan transcriptomische analyse een goede optie zijn bij de identificatie en uitgebreide analyse van EndMT-gerelateerde regulatoren. We raden aan om verschillende complementaire benaderingen te gebruiken om de modulatie van EndMT te onderzoeken.
Samengevat hebben we een workflow geïntroduceerd om factoren te identificeren die functionele rollen kunnen spelen tijdens TGF-β-geïnduceerde EndMT. Deze methode kan ook worden gebruikt om te bestuderen of andere stimuli (d.w.z. cytokinen, groeifactoren, mechanische stimuli, celcelinteracties) EndMT kunnen moduleren en het samenspel van TGF-β met andere stimuli. Daarnaast hebben we een aanpak uitgelicht met behulp van CRIPSR/Cas genbewerking om uit te leggen of een bepaald gen nodig is voor TGF-β-geïnduceerde EndMT. Om deze methodologie te illustreren, gebruikten we de sterke EndMT-inductor TGF-β2 in MS-1-cellen, maar de protocollen kunnen worden aangepast aan andere cytokinen en andere celtypen. We verwachten dat dit beschreven gedetailleerde protocol zal dienen als opstapje voor toekomstige EndMT-gerelateerde studies.
The authors have nothing to disclose.
Het onderzoek werd ondersteund door CGC.NL en het Netherlands Cardio Vascular Research Initiative: de Nederlandse Hartstichting, de Nederlandse Federatie van Universitair Medische Centra, de Nederlandse Organisatie voor Gezondheidsonderzoek en -Ontwikkeling en de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Subsidie toegekend aan de Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM wordt ondersteund door de Chinese Scholarship Council. GSD wordt ondersteund door een Trampoline-subsidie van AFM-Telethon [22379], FOP Italia en een subsidie van La Fundació La Marató de TV3 (#202038).
0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |