Summary
我们通过观察细胞形态变化和使用免疫荧光染色检查表达 EndMT 相关标记变化来描述在内皮细胞中研究 TGF-β2 诱导 EndMT 的方法。CRISPR/Cas9基因编辑被描述并用于耗尽编码蜗牛的基因，以调查其在TGF-+2诱发的EndMT中的作用。
Abstract
为了响应特定的外部线索和某些转录因子的激活，内皮细胞可以分化成类似发音的表型，这个过程被称为内皮的中微子过渡（EndMT）。最新结果表明，EndMT与多种人类疾病（如纤维化和癌症）有因果关系。此外，内皮衍生的间质细胞可应用于组织再生过程，因为它们可以进一步分化为各种细胞类型（如骨细胞和软骨细胞）。因此，选择性地操纵 EndMT 可能具有临床潜力。与上皮-感性过渡（EMT）一样，EndMT 可以强烈地由分泌的细胞因子转换生长因子-β （TGF-β） 引起，后者刺激所谓的 EndMT 转录因子 （EndMT-TFs） 的表达，包括蜗牛和 Slug。然后，这些 EndMT-TF 分别调节间质蛋白和内皮蛋白的水平。在这里，我们描述了在体外研究TGF-β诱发的EndMT的方法，包括研究特定TF在TGF-β诱导的EndMT中的作用的协议。利用这些技术，我们提供了证据，证明TGF-β2刺激了Murine胰腺微血管内皮细胞（MS-1细胞）中的EndMT，并且蜗 牛 利用聚集的定期间歇短乳液重复（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）介质基因编辑，消除了这种现象。这种方法可以作为一个模型来询问内皮生物学的潜在调节器，并可用于执行遗传或药理学筛查，以确定 EndMT 的新调节器，在人类疾病中具有潜在的应用。
Introduction
内皮到间质过渡（EndMT）是一种多步骤和动态的生物现象，已经与不同的生理和病理过程1，2。在 EndMT 内皮细胞逐渐失去内皮特征时，同时获得中性属性3：因此，紧密压缩和组织良好的内皮细胞分化成拉长的中微细胞状细胞。EndMT 中的形态变化与某些基因和蛋白质表达的改变相吻合。一般来说，维持内皮特性的蛋白质的表达，包括血管内皮（VE）-卡德林、血小板/EC粘附分子-1（CD31/佩卡姆-1）下降。同时，与间质功能相关的蛋白质，如α光滑的肌肉作用素（α-Sma）和平滑肌肉蛋白22+（Sm22+）积累。最新结果表明，产后末期MT有助于人类疾病的发展，如癌症、心肌纤维化、肺动脉高血压（PAH）、动脉粥样硬化（AS）、器官纤维化等2、4、5、6、7。更深入地了解 EndMT 的基本机制以及如何指导 EndMT 过程将为 EndMT 相关疾病和再生医学提供新的治疗方法。
TGF-β是EndMT诱导剂之一，其他已知的相关因素包括Wnt/β-卡泰宁、诺奇和一些炎症细胞因子1。由于蜂窝上下文是 TGF-β触发响应的关键，因此 TGF-β与其他 EndMT 促进信号的相互作用与 TGF-β引起 EndMT 响应相关。在激活TGF-β细胞表面I型和II型血清/三氨酸激酶受体后，细胞内规范的Smad通路被激活。TGF-β受体介导的磷酸Smad2/3与Smad4形成异质复合物，迁移到细胞核中，在那里它们调节了EndMT相关转录因子的表达。类似于上皮-发炎性过渡（EMT），转录因子，如蜗牛，斯拉格，扭曲，Zeb1和Zeb2是由TGF-β信号诱导的，并有助于EndMT8的基因重新编程。
蜗牛经常被确定为 EndMT 中的一个关键因素。蜗牛与编码细胞粘附蛋白的基因的促进者结合，并抑制其转录，通过增强中性蛋白9的表达来抵消转录。内皮细胞由非常异质的种群组成，不同细胞外刺激对EndMT的相对影响可能因内皮细胞背景或细胞类型10而异。由于它与EMT的相似性，一些方法对调查EMT和EndMT8的机制都很有用。在这方面，EMT国际协会（TEMTIA）强调需要互补技术，以最终证明EMT/EndMT11的发生。
在这里，我们描述了一种监控和可视化 TGF-β 诱导的 EndMT 过程的方法。免疫荧光染色提供了靶向蛋白质/标记物表达变化的基本信息，这些信息用于指示 EndMT 过程是否发生。此外，免疫荧光染色可以可视化蛋白质/标记物和细胞形态的本地化。为了研究特定 TF（或其他上游或下游调节器）参与 TGF-β调解 EndMT 的潜在活动，我们使用 TGF-Snail 作为示例，使用分组定期间歇短柱重复 （CRISPR） / CRISPR 相关蛋白质 9 （Cas9） 基因编辑来耗尽细胞中的特定基因的协议。Cas9是一种双RNA制导的DNA内核酶，它识别和切割与细菌12中的CRISPR序列相辅相成的序列。CRISPR/Cas9系统目前被广泛使用，因为它促进体外遗传工程和体内13。由单个指南RNA（sgRNA）指导，异位表达的Cas9在特定基因位点的预选靶向序列中产生双链断裂。非同源端连接 （NHEJ） 通过随机核苷酸插入或删除来修复 Cas9 诱发的链断裂，从而导致目标基因的中断和失活。我们详细描述了设计选择性 sgRNA 和生成包含设计 sgRNA 的扁豆兼容载体的方法。因此，稳定的基因耗尽内皮细胞可以以高效和可靠的方式产生。
在这项研究中，我们使用穆林胰腺微血管内皮细胞（MS-1）14作为模型系统来检查TGF-+2诱导的EndMT过程。我们先前的研究表明，蜗牛是TGF-+2增加的主要转录因子，通过TGF-+2，EndMT在MS-1细胞15中诱导。在CRISPR/Cas9基因编辑以消除MS-1细胞中的蜗牛表达后，TGF-β2未能调解EndMT。此工作流可用于研究其他（疑似）EndMT 相关基因。
Protocol
1. TGF-+2 引入末端MT
- Dulbecco 改良鹰介质 （DMEM） 中的 MS-1 细胞在孵化器中含有 10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 100 U/mL 青霉素/链霉素 （5% CO2， 37 °C）。使用前10分钟用0.1%的明胶涂抹所有文化菜肴/盘子。
- 用1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻清洗MS-1细胞，在37°C处加入2毫克的三氯辛-EDTA溶液（0.25%的三氯苯酚素和0.02%的EDTA）到10厘米的盘子中，并在37°C处孵育2分钟以分离它们。随后，添加5mL的完整文化介质来淬灭反应。
- 在室温下将细胞悬架转移到 15 mL 管和离心机，在 200 x g 下 3 分钟。
- 丢弃超自然物质，在含有 FBS 和青霉素/链霉素的新鲜介质的 4 mL 中重新注入细胞。使用自动细胞计数器数数细胞。
- 种子 1 x 103 细胞每厘米2 为进一步培养.例如，6 井板的种子 9.5 x10 3 细胞/井，或 24 井板的 1.9 x10 3 细胞/井。
- 在一夜之间孵化细胞，使其粘附和恢复，然后用 TGF-β 刺激 MS-1 细胞 3 天。在TGF-β2刺激前30分钟加入TGF-β受体激酶抑制剂SB431542（5μM）。使用车辆 （DMSO） 处理其他细胞。
注：在含有0.1%人牛血清白蛋白（BSA）的4mM HCl中溶解TGF-β2。在控制组中添加相同数量的无 TGF-β2 的配体缓冲区。TGF-β2浓度可调整为0.1-1 ng/mL，以进行特定检测。请参阅相应数字中的指示。 - 3天后，用明亮的场成像（用倒置显微镜）检查细胞形态，并进行免疫荧光染色（见第2步），以评估 EndMT 相关标记的变化。至少进行三次独立的实验以获得生物三脚架。
2. 免疫荧光染色
- 尝试培养MS-1细胞（步骤1.2），然后在放置在24井板底部的12毫米圆形盖玻璃上重新种子1.9 x 103 细胞。
- 在一夜之间培养细胞后，将TGF-β2（最终浓度为1 ng/mL）添加到细胞中3天。使用含有配体缓冲器的介质作为负控件。
- 执行佩卡姆-1和Sm22®染色。
- 在用TGF-β（或控制）刺激细胞3天后，取出介质，用1倍PBS清洗细胞。
- 在每个井中加入300微升4%甲醛，在室温下孵育10分钟以修复细胞。孵化后用1倍PBS清洗3倍。
- 在 1x PBS 中加入 300 μL 的 0.1% Triton X-100 到每个井中，并在室温下孵育 10 分钟，以渗透细胞。孵化后，取出 Triton X-100 溶液，用 1 倍 PBS 清洗细胞 3 倍。
- 在室温下用 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 在 1x PBS 中阻断细胞 45 分钟。
- 用 1 倍 PBS 稀释识别穆林蛋白的主要 Pecam-1 和 Sm22® 抗体 1：500。然后在室温下用原抗体孵育固定细胞45分钟。
- 用1倍PBS清洗3次后，用1000倍稀释的二次抗体孵育细胞，包括驴抗鼠亚历克萨488和山羊抗兔亚历克萨594，在室温下45分钟。
注意：在染色过程中保护样品免受光线的伤害。 - 用 1 倍 PBS 冲洗 3 倍后，将带有细胞的盖玻璃朝下放在含有 4'，6-2-苯林多 （DAPI） 的安装介质上，以弄脏核。
- 用透明指甲油修复盖玻璃的外围，并将其存放在 4 °C。
- 用对焦显微镜获取代表性图像。将激光波长设置为 405 nm、488 nm 和 552 nm，分别检测 DAPI、佩卡姆-1 和 Sm22®。对于每个频道，所有图片都是以相同的设置和曝光时间拍摄的。至少进行三次独立的实验以获得生物三脚架。
3. 使用 CRISPR/Cas9 编辑从 蜗牛 中敲出
- 设计两个独立的sgRNA针对穆林 蜗牛。
- 使用在线工具CHOCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/）和Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）根据目标基因名称和物种设计sgRNA。
- 通过两个独立的算法（包括 Cas-OFFinder （http://www.rgenome.net/cas-offinder/） 和 CHOPCHOP （http://chopchop.cbu.uib.no/）预测针对蜗牛设计的 sgRNA 的非目标活动。
- 选择两个活动最少的 sgRNA。设计两个互补的sgRNA寡头与 BveI切割网站。感寡头从 5 '- accg - 3' 开始， 反感寡头从 5 '- Aac - 3' 开始。
- 订购用于进一步使用的商业合成寡头。
- 将互补指南RNA寡头克隆到BveI消化AA19 pLKO.1-纯净.U6.sgRNA中。大道I-馅料伦蒂维拉尔矢量质粒生成AA19 pLKO.1-蜗牛-斯格纳16。
- 切断 AA19 pLKO.1- 纯净. u6.sgRNA。大道我馅质粒与 BveI 酶16。混合 2μg 的 AA19 pLKO.1-纯净. u6.sgRNA。大道I-馅料质粒，5μL的10倍缓冲O，和5μL的 BveI酶，并添加无菌水，达到总体积50μL。
- 漩涡和短暂地旋转反应组合。在37°C下孵化反应1小时。
- 将反应混合物加载到1%的蔗糖凝胶上，并在1x三叶草乙酸酯-EDTA（TAE， 50x TAE 库存：242 克 Tris 碱溶解在水中，57.1 mL 的冰川醋酸、100 毫升的 500 mM EDTA （pH 8.0） 溶液，并将水添加到总共 1 升）缓冲中，直到实现良好的分离。
- 从凝胶中切下骨干片段，根据制造商的协议（参见 材料表）用凝胶提取套件将其隔离，并在 40μL elution 缓冲器 （EB） 中提取骨干。
- 将 5 μL 的 100 pmol/μL 感奥利戈和 5 μL 的 100 pmol/μL 抗感寡头与 1 μL 的 1 M 特里斯-HCl （pH 8.0） 混合，并加入无菌水，使 gRNA 寡头的退化达到 100 μL。在 100 °C 下将混合物孵化 5 分钟，然后用铝箔覆盖管子。之后，慢慢冷却室温溶液，以进一步用作插入物。
- 为了利化互补的 gRNA 寡头和 Bve我消化的骨干， 混合1μL的孤立 BveI削减AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-填充骨干和2μL的插入（稀释1：300）与2μL的10x T4DNA韧带缓冲器和1μL的T4DNA韧带， 并添加无菌水，以达到20μL。 短暂旋转管子，并在室温下孵育4小时，以供进一步使用。
注意：执行结定时，确保包括两个控制组。对于一个对照组，混合1μL的分离骨干，2μL的10x T4DNA韧带缓冲器，和1μL的T4DNA韧带，并添加无菌水达到总共20μL，但没有寡头DNA。对于另一个对照组，混合1μL的分离骨干和2μL的10x T4DNA韧带缓冲器，并添加无菌水达到共20微l，但没有退化寡头和T4韧气。这两种控制性配对用于确定下一个转换步骤中的反应背景，并指示套着的效率。
- 将反应混合物转化为称职的TOP10大肠杆菌。
- 收集称职的TOP10 大肠杆菌。细胞从-80°C冰柜，并在冰上解冻。
- 将 2μL 的结定混合物添加到 50 μL 的称职细胞中，并将管子保持在冰上 30 分钟。
- 在 42 °C 的 30 年代将管子加热到 42 °C。把管子放在冰上2分钟。
- 在混合物中加入 950 μL 的新鲜溶酶肉汤 （LB） 介质，在 37 °C 下剧烈摇晃 60 分钟。
- 向下旋转，将细胞放在温暖的安培林（100微克/毫升）耐药性LB板上。在 37 °C 的夜间孵化板。
- 验证 gRNA 寡头在质粒中的成功插入。
- 在含有LB介质的1毫升安皮西林（100μg/mL）中挑选3-5个菌落，在30°C下摇动一夜。
- 根据制造商的协议（材料表）将质粒DNA与质粒套件分离，并与 U6 促进器引物 5'- GAGGCTCTCTCTCATCATGATT -3' 进行测序，以验证 gRNA 寡头的成功插入。
4. 生成蜗牛淘汰 MS-1 细胞
- 产生携带 Cas9 或蜗牛靶向 gRNA 的扁桃体颗粒。
- 培养 HEK 293T 细胞在 DMEM 中含有 10% 胎儿牛血清和 100 U/mL 青霉素/链霉素在 14.5 厘米菜肴 （或 T75 烧瓶） 在孵化器 （5% CO2，37 °C）.
- 将 9.9 μg 的靶向基因质粒、AA19 pLKO.1-蜗牛-sgRNA 或 pLV-Cas917 质粒混合，以及帮助质粒 3.5 μg 的 pCMV-VSVG（编码血管口腔炎病毒的 G 蛋白， VSV-G），6.6微克转速响应元素质粒pMDLg-RRE（编码加格和波尔），和5.0微克的pRSV-REV（编码修订版）在500微L的血清自由介质。在 500 μL 的无血清介质中补充 50 μL 聚乙酰氨基宁 （PEI） （2.5 毫克/mL）。通过上下管道轻轻混合质粒和 PEI 制剂。在室温下将混合物孵育20分钟。
- 通过在 14.5 厘米的菜肴（或 T75 烧瓶）中加入从步骤 4.1.2 到 80% 的汇合细胞的混合物介质来传输 HEK 293T 细胞，其中含有 DMEM 介质，其中含有 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素。HEK293T细胞之所以被使用，是因为它们很容易被传播，并产生高水平的病毒18。
- 将受感染的 HEK 293T 细胞转移到微生物和生物医学实验室 （BMBL） 的生物安全中，以培养它们 24 小时。
- 在 BMBL 实验室中，用含有 FBS 和青霉素/链霉素的 12 毫升新鲜完整 DMEM 替换 HEK 293T 细胞的转染介质。孵化细胞24小时。
- 使用 20 mL 注射器和 0.45 μm 过滤器收集和过滤介质。将条件介质转移到 15 mL 聚丙烯管中。
- 在 HEK 293T 培养皿和文化中加入 12 毫升含有 FBS 和青霉素/链霉素的新鲜完整 DMEM，再加 24 小时。
- 使用 20 mL 注射器和 0.45 μm 过滤器收集和过滤介质。将条件介质转移到 15 mL 聚丙烯管中。将含有扁桃体颗粒的介质存储为 -80 °C 的 1 mL 等离子报价，以供进一步使用。
- 感染MS-1细胞与pLV-Cas9病毒。
- 种子 1 x 105 MS-1 细胞每井在 6 井板 24 小时之前扁豆病毒感染.
- 在 37 °C 的水浴中解冻 pLV-Cas9 病毒的冷冻单列。
- 将 1 毫升病毒介质与含有 FBS 和青霉素/链霉素的新鲜 DMEM 介质混合 1 mL。将聚苯加入介质（最终浓度为10微克/mL），以提高感染效率。
- 从 6 井板中取出介质，代之以病毒/聚苯混合介质，并在感染后在孵化器中培养细胞 24 h. 24 h，用新鲜介质替换介质，将细胞培养 24 h。
注意：始终保持未受感染的组和对照组。 - 吸气介质从感染组和对照组，并替换它与DMEM介质4μg/mL爆破素。
- 将盘子返回到 37 °C 的孵化器，培养细胞 1 周。未受感染的细胞将因爆炸性杀伤素的作用而死亡。当存活细胞达到80%的细胞结合时，分离它们，并继续选择爆炸性丁。
- 使用抗体对 Cas9 进行西印确认 MS-1 细胞中的 Cas9 表达（Cas9 的分子重量约为 160 kDa）。
- 单独感染pLV-Cas9 MS-1细胞与两个独立的gRNA扁豆病毒。
- 种子 1 x 105 pLV-Cas9 MS-1 细胞每井在 6 井板 24 小时感染前。
- 按照 4.2 中描述的相同协议，分别感染两种 gRNA 扁豆病毒的细胞。
- 在24小时感染gRNA病毒后，刷新介质并培养细胞24小时。
- 用 1μg/mL 普洛霉素替换介质。将盘子返回到 37 °C 的孵化器，培养细胞 1 周。确保未受感染的细胞完全死亡。当细胞达到80%的汇流时，分裂细胞，并继续选择普洛霉素。
- 使用抗蜗牛的抗体（蜗牛的分子重量约为35 kDa），通过西式印迹确认MS-1细胞中蜗牛的淘汰。
Representative Results
TGF-β2 诱导 EndMT 并刺激 MS-1 内皮细胞中的蜗牛表达
TGF-β是诱导末端MT的最大潜力的细胞因子之一。在用TGF-β2（1 ng/mL）治疗MS-1细胞3天后，内皮MS-1细胞失去鹅卵石状结构，分化成主轴状的间质状细胞（图1A）15。为了进一步验证TGF-β2在诱导细胞表型变化方面的作用，我们在TGF-+2刺激19之前用小分子活体受体样激酶（ALK）4/ALK5/ALK7抑制剂SB431542对细胞进行了预处理。SB431542 完全废除了 TGF-β2 诱导的细胞形态变化 （图 1A）。通过研究末端MT相关标记的表达变化，进一步调查了TGF-β2诱导的EndMT过程。如图1B所示，在TGF-β2刺激后，内皮蛋白Pecam-1被有效降低，而间质因子Sm22®则被TGF-β215严重地加高了调节。这些数据与 TGF-β2 在 MS-1 单元中触发 EndMT 的概念一致。接下来，我们调查了TGF-β2对蜗牛和蜗牛表达的影响。如图1C所示，蜗牛明显受到TGF-β的调节，而Slug表达不受MS-1细胞15中的TGF-β的影响。从三个独立的实验中对蜗牛表达的定量显示在图1D中。
在MS-1内皮细胞中，由CRISPR/Cas9消耗蜗牛
由于蜗牛是由TGF-β2诱导的，并且可能参与TGF-+2介导的EndMT，我们进行了CRISPR/Cas9基因编辑，以基因耗尽MS-1细胞中的蜗牛表达。我们假设蜗牛的耗竭足以抑制TGF-+2诱发的末端MT。如图2A所示，我们分两步生成蜗牛淘汰细胞。首先，Cas9通过用Cas9表达扁豆病毒感染MS-1细胞来表达异位。由于pLV-Cas9结构中有一个防爆素电传，我们通过西方对抗爆丁的细胞（图2D）的污点分析检查了Cas9的表达。随后，我们推出了专门针对蜗牛的sgRNA，以破坏其蛋白质表达。这个过程也是通过感染携带AA19 pLKO.1-蜗牛-sgRNA构造的扁桃体颗粒进行的，其中包括一个普洛霉素表达盒。Cas9表达细胞再次感染了含有扁豆病毒的gRNA，并进一步选择了普洛霉素。两个针对穆林蜗牛的互补性 sgRNA 寡头设计具有预测的低目标活动 （图 2B，C）。在Cas9中引入两个独立的蜗牛sgRNA表达MS-1细胞后，蜗牛蛋白表达被废除（图2D）15。
蜗牛缺乏抑制MS-1细胞中的TGF-+2诱发的末端MT
为了在TGF-+2介质的EndMT中证明蜗牛的功能，我们在蜗牛耗尽的细胞中进行了EndMT检测，并将其与父母MS-1细胞进行比较。如图3A所示，蜗牛的淘汰足以抑制MS-1细胞15中TGF-β驱动的类似成纤维细胞的细胞形态。此外，在蜗牛耗尽的MS-1细胞中，由TGF-β2介质的Pecam-1下降和Sm22®的增强被完全阻断。总之，我们证明蜗牛对MS-1细胞（图3B）15中的TGF-+2介质末端MT至关重要。
图1。TGF-β2在MS-1细胞中诱导末端MT和蜗牛表达。A.TGF-β2和/或TGF-β I型受体激酶抑制剂SB-431542对细胞形态的影响。使用 TGF-β2 （1 ng/mL） 和/或 SB-431542（SB， 5 μM，在 TGF-β 之前 30 分钟施用）治疗时，MS-1 细胞的明亮场图像，为期 2 天。比例栏表示 200μm. B。在含有TGF-β2（1 ng/mL）的中等培养的MS-1细胞中，对佩卡姆-1（绿色）和Sm22®（红色）进行免疫荧光染色3天。核以蓝色 （DAPI） 可视化。比例杆：50μm.C.西斑，整个细胞的TGF-β2刺激MS-1细胞。 蜗牛的表达，但不是斯拉格，通过TGF-+2刺激，如先前在马等人15报道。D.通过整合三个独立的西方污点实验的结果来量化蜗牛的表达。请单击此处查看此图的较大版本。
图2。通过CRISPR-Cas9基因编辑耗尽 蜗牛 。A. 描述如何生成 蜗牛 淘汰细胞的方案。Bsd： 爆破剂。普洛：普洛霉素。 B. 使用乔乔普 （http://chopchop.cbu.uib.no/） 和卡斯 - 奥芬德 （http://www.rgenome.net/cas-offinder/） 瞄准 蜗牛 的两个独立 sgrna 的寡头核苷酸。C. 使用 Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）预测的蜗 牛 两个 gRNA 的非目标活动。D. 由西方污点分析测量的野生类型 （WT） 和 Cas9 过度表达的 MS-1 中的 Cas9 和蜗牛表达。 E. 根据西方污点分析，在MS-1细胞中用两个独立的gRNA敲掉 蜗牛 。我们在马等人15日报告了类似的结果。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。蜗牛的遗传耗竭抑制MS-1细胞中的TGF-+2诱发的末端MT。A. 与TGF-β2（0.1 ng/mL）治疗后，MS-1细胞在野生型（WT、上面板）和 蜗牛 中敲出（下面板）细胞3天的光明场图像。比例杆表示 200μm. B. 佩卡姆-1 （绿色）、Sm22® （红色） 和核 （蓝色） 的免疫荧光染色，在含有 TGF-α（1 ng/mL） 的介质中培养 3 天。 蜗牛 的耗竭废除了 TGF-β2 诱发的佩卡姆 - 1 的减少和 Sm22® 表达的增加。比例杆表示 50μm. C. Schematic 表示 蜗牛 淘汰对 MS-1 细胞中 TGF-β诱导的 EndMT 的影响。TGF-β通过磷酸化 Smad2/3 和进一步驱动 EndMT 来刺激 蜗牛 通过 Smad 通路的表达。使用 CRISPR/Cas9 基于基因编辑的已废除的 TGF-β介质 EndMT 敲出 蜗牛 。 请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
了解 EndMT 的机制对于调节此过程和针对末端MT 相关疾病至关重要。在这里，我们描述了执行TGF-β诱导的EndMT检测的方法，并通过执行CRISPR/Cas9介导的蜗牛从细胞中分离出稳定基因来询问EndMT-TF蜗牛在TGF-β触发的EndMT中的作用。使用CRISPR/Cas9方法的蜗牛耗尽成功地在MS-1细胞（图3C）中废除了TGF-β2驱动的末端MT。为了研究任何细胞因子（如TGF-β）对EndMT的影响，ECs暴露在细胞因子中，然后根据形态变化和细胞内皮和发痒标记表达变化来评估EndMT的发生。TGF-β2 在 MS-1 细胞中强烈诱导 EndMT，同时转录因子蜗牛的表达量也随之强劲增加。TGF-β诱导的末端MT-TFs可能因物种或组织特异性内皮细胞类型而异。例如，我们观察到蜗牛（但不是蜗牛）在MS-1细胞中被TGF-β显著提升，而在人类脐带内皮细胞（HUVECs）中，蜗牛和蜗牛在接触TGF-β 20后均增加。
我们通过检查细胞形态变化，然后通过调查 EndMT 相关标记表达的变化，以两种方式评估 EndMT 过程的程度。TGF-β暴露3天后，细胞接受EndMT，其形态变化和EndMT相关标记的表达变化一致。除了我们在这里进行的免疫荧光染色，标记变化也可以通过西方在蛋白质表达水平或qRT-PCR（实时定量反转录PCR）在基因水平21监测。除了我们在本协议中展示的这两种节省时间和成本的方法外，还有其他方法可以检查 EndMT。例如，执行转录体分析（通过RNA测序或qPCR）来比较治疗和控制细胞之间内皮和间皮相关基因的表达水平，可以精确评估EndMT 22，23。此外，EndMT 通常涉及障碍功能的稳定损失，可以通过阻抗光谱24来评估。此外，还可检查 EndMT 衍生细胞获得干细胞样特性的额外证据。例如，在特定的培养条件下，EndMT类似发痒的细胞可以进一步分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或（肌）成纤维细胞。因此，确认不同细胞类型的分化属于中皮谱系（即基因表达和基质染色）的附加分析有助于证明 EndMT 衍生细胞的多能性质。最后，EndMT 评估方法不限于体外研究，但可以推断出 EndMT 与体内或前体内器官中某些疾病之间的关系。从这个意义上说，内皮特定血统追踪策略的使用被广泛扩展到 EndMT 相关研究25。
为了研究蜗牛在EndMT中的作用，在这项研究中，CRISPR/Cas9基因编辑被用来敲除这个基因。数据显示，TGF-β2未能在蜗牛缺乏的MS-1细胞中调解末端MT。这一观察表明，蜗牛对MS-1细胞中的TGF-β2诱导末端MT至关重要。我们使用独立的 U6 驱动 sgRNA 表达式磁带为 Cas9 引入特定的 sgRNA 来瞄准 蜗牛。 除了这种方法，Ran等人26 描述了将sgRNA寡头序列克隆到Cas9脚手架中以生成包含Cas9和gRNA的构造的另一种策略。新兴的新方法允许 CRISPR/Cas 合并其他功能。例如，通过向表达 Cas927的细胞中提供更多的 sgRNA，可以实现双或三次淘汰。工程的Cas13蛋白质靶向和消化RNA分子，而不会破坏内源性DNA28。除了用CRISPR/Cas敲除基因外，短发夹RNA（shRNA）可以用作稳定地击倒目标基因表达29的替代品。对于所有 CRISPR / Cas 基因编辑方法，应始终考虑脱靶。此外，小干扰RNA（siRNA）暂时沉默基因表达和siRNA浓度被稀释与细胞分裂30。这两种方法都部分抑制了靶向基因表达。相比之下，异位基因表达也用于验证EndMT/EMT31期间的基因功能。这种方法可以确定基因的上调节是否足以引起 EndMT 响应。因此，目前有多种技术战略可用于识别和验证 EndMT 的潜在监管机构。此外，转录分析是EndMT相关监管机构识别和综合分析的一个良好选择。我们建议使用不同的补充方法来调查 EndMT 的调制。
总之，我们引入了一个工作流程，以识别在 TGF-β 诱导的 EndMT 期间可能起作用的因素。这种方法还可用于研究其他刺激（即细胞因子、生长因子、机械刺激、细胞-细胞相互作用）是否可以调节 EndMT，以及 TGF-β与其他刺激的相互作用。此外，我们强调了使用CRIPSR/Cas基因编辑的方法，以阐明TGF-β诱导的EndMT是否需要某种基因。为了说明这种方法，我们在MS-1细胞中使用了强的EndMT诱导剂TGF-β2，但协议可以适应其他细胞因子和其他细胞类型。我们预计，上述详细的协议将成为未来 EndMT 相关研究的垫脚石。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了 CGC.NL 和荷兰心血管研究倡议的支持：荷兰心脏基金会、荷兰大学医学中心联合会、荷兰健康研究与发展组织以及授予费德拉影响（http://www.phaedraresearch.nl）的荷兰皇家科学院赠款。JM得到中国奖学金委员会的支持。GSD得到非洲解放运动-电信[22379]、意大利联邦体育局和马拉蒂电视3号基金会（#202038）的电车赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
| 10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
| 12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
| 20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
| AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
| Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
| Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
| Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
| Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
| Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
| Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
| BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
| Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
| Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
| LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
| MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
| Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
| PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
| PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
| Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
| Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
| TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
| Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
| Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
| Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |
References
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