Summary
Vi beskriver metoder for å undersøke TGF-β2-indusert EndMT i endotelceller ved å observere cellemorfologiendringer og undersøke uttrykket EndMT-relaterte markørendringer ved hjelp av immunfluorescensfarging. CRISPR/Cas9 genredigering ble beskrevet og brukt til å tømme genkodingen Snail for å undersøke sin rolle i TGF-β2-indusert EndMT.
Abstract
Som svar på spesifikke eksterne signaler og aktivering av visse transkripsjonsfaktorer, kan endotelceller skille seg ut i en mesenchymal-lignende fenotype, en prosess som kalles endotel til mesenchymal overgang (EndMT). Nye resultater har antydet at EndMT er årsaksmessig knyttet til flere menneskelige sykdommer, som fibrose og kreft. I tillegg kan endotel-avledede mesenchymale celler brukes i vevregenereringsprosedyrer, da de kan differensieres ytterligere i ulike celletyper (f.eks. osteoblaster og kondrocytter). Dermed kan selektiv manipulering av EndMT ha klinisk potensial. I likhet med epitelial-mesenchymal overgang (EMT) kan EndMT sterkt induseres av de utskilte cytokintransformerende vekstfaktor-beta (TGF-β), som stimulerer uttrykket av såkalte EndMT-transkripsjonsfaktorer (EndMT-TFs), inkludert Snail og Slug. Disse EndMT-TF-ene opp- og nedregulerte nivåene av henholdsvis mesenchymale og endotelproteiner. Her beskriver vi metoder for å undersøke TGF-β-indusert EndMT in vitro, inkludert en protokoll for å studere rollen til bestemte TFer i TGF-β-indusert EndMT. Ved hjelp av disse teknikkene gir vi bevis på at TGF-β2 stimulerer EndMT i murine bukspyttkjertelmikrovaskulære endotelceller (MS-1 celler), og at den genetiske uttømmingen av snegl ved hjelp av klynger regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)/CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9)-mediert genredigering, avviker dette fenomenet. Denne tilnærmingen kan fungere som en modell for å forhøre potensielle moduler av endotelbiologi, og kan brukes til å utføre genetiske eller farmakologiske skjermer for å identifisere nye regulatorer i EndMT, med potensiell anvendelse i menneskelig sykdom.
Introduction
Endotel til mesenchymal overgang (EndMT) er et multistep og dynamisk biologisk fenomen som har vært knyttet til ulike fysiologiske og patologiske prosesser1,2. Ved EndMT endotelceller mister gradvis sine endoteliske egenskaper, mens de kjøper mesenchymale egenskaper3; Dermed skiller tett komprimerte og godt organiserte endotelceller seg i langstrakte mesenchymale celler. Morfologiske endringer i EndMT sammenfaller med endringer i uttrykket av visse gener og proteiner. Generelt avtar uttrykket av proteiner som opprettholder endotelkarakteristikker, inkludert vaskulær endotelial (VE)-kadherin, blodplate / EC adhesjonsmolekyl-1 (CD31 / Pecam-1). Samtidig akkumuleres proteiner relatert til mesenchymale funksjoner, som α-glatt muskel actin (α-Sma) og glatt muskelprotein 22α (Sm22α). Nye resultater har vist at postnatal EndMT bidrar til utvikling av menneskelige sykdommer, som kreft, hjertefibrose, lungearteriell hypertensjon (PAH), aterosklerose (AS), organfibrose, etc2,4,5,6,7. En dypere forståelse av de underliggende mekanismene for EndMT og hvordan man styrer EndMT-prosessen vil gi nye terapeutiske metoder for EndMT-relaterte sykdommer og regenerativ medisin.
TGF-β er en av de viktigste EndMT-induserne, og andre kjente involverte faktorer inkluderer Wnt / β-catenin, Notch og noen inflammatoriske cytokiner1. Siden mobilkonteksten er nøkkelen for svar utløst av TGF-β, er samspillet mellom TGF-β med andre EndMT-promoteringssignaler relevant for TGF-β å fremkalle en EndMT-respons. Ved aktivering av TGF-β celleoverflate type I og type II serin / treoninkin kinase reseptorer, aktiveres den intracellulære kanoniske Smad-banen. TGF-β reseptormediert fosforylert Smad2/3 danner heteromeriske komplekser med Smad4 som omfordeler seg til kjernen, hvor de oppregulerer uttrykket av EndMT-relaterte transkripsjonsfaktorer. I likhet med epitelial-mesenchymal overgang (EMT), blir transkripsjonsfaktorer som Snail, Slug, Twist, Zeb1 og Zeb2 indusert av TGF-β signalering og bidra til genomprogrammering i EndMT8.
Snegl har ofte blitt identifisert som en nøkkelfaktor i EndMT. Snegl binder seg til promotoren av gener som koder cellecelleadhesjonsproteiner og undertrykker transkripsjonen, som motvirkes av forbedringen av uttrykket av mesenchymale proteiner9. Endotelceller utgjør en svært heterogen populasjon, og den relative påvirkningen av ulike ekstracellulære stimuli på EndMT kan variere mellom endotelbaserte cellulære kontekster eller celletyper10. På grunn av likhetene med EMT, er noen metoder nyttige for å undersøke begge mekanismene EMT og EndMT8. I denne forbindelse understreker EMT International Association (TEMTIA) sterkt behovet for komplementære teknikker for til slutt å demonstrere forekomsten av EMT / EndMT11.
Her beskriver vi en metode for å overvåke og visualisere den TGF-β-induserte EndMT-prosessen. Immunfluorescensfarging gir grunnleggende informasjon om uttrykksendringer i målrettede proteiner/markører, som brukes som indikatorer på om EndMT-prosessen oppstår. I tillegg kan immunfluorescensfarging visualisere lokalisering av proteiner/markører og cellemorfologi. For å studere den potensielle aktiviteten til spesifikke TFer (eller andre oppstrøms- eller nedstrømsregulatorer) som er involvert i TGF-β mediert EndMT, beskriver vi en protokoll ved hjelp av grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) genredigering for å tømme spesifikke gener fra celler, ved hjelp av TF-sneglen som eksempel. Cas9 er en dobbel RNA-guidet DNA-endonuklease som gjenkjenner og cleaves sekvenser komplementære til CRISPR sekvenser i bakterier12. CRISPR / Cas9-systemet er for tiden mye brukt fordi det letter genteknologi in vitro og in vivo13. Regissert av en enkelt guide RNA (sgRNA), uttrykker ektopisk Cas9 genererer en dobbel tråd pause på en forhåndsvalgt målretting sekvens i et bestemt gen locus. Ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) finner sted for å reparere Cas9-induserte strandbrudd, via tilfeldige nukleotidinnsettinger eller slettinger og dermed føre til forstyrrelse og inaktivering av det målrettede genet. Vi beskriver i detalj metoder for å designe selektive sgRNAer og generere lentiviral-kompatible vektorer som inneholder de designede sgRNAene. Som et resultat kan stabile genutarmede endotelceller genereres på en effektiv og pålitelig måte.
I denne studien brukte vi murine bukspyttkjertelmikrovaskulære endotelceller (MS-1)14 som et modellsystem for å undersøke den TGF-β2-induserte EndMT-prosessen. Vår forrige studie viste at Snail er den viktigste transkripsjonsfaktoren økt av TGF-β2, hvoretter EndMT induserer i MS-1 celler15. Ved CRISPR/Cas9 genredigering for å abrogate Snail uttrykk i MS-1 celler, TGF-β2 klarte ikke å megle EndMT. Denne arbeidsflyten kan brukes til å studere andre (mistenkte) EndMT-relaterte gener.
Protocol
1. Induksjon av EndMT av TGF-β2
- MS-1 celler i Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) som inneholder 10% foster bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin / streptomycin i en inkubator (5% CO2,37 °C). Strøk alle kulturretter/tallerkener med 0,1 % m/v gelatin i 10 minutter før bruk.
- Vask FORSIKTIG MS-1-celler med 1x fosfatbufret saltvann (PBS), tilsett 2 ml trypsin-EDTA-oppløsning (0,25% trypsin og 0,02% EDTA) til en 10 cm tallerken, og inkuber i 2 minutter ved 37 °C for å løsne dem. Deretter legger du til 5 ml komplett kulturmedium for å slukke reaksjonen.
- Overfør cellefjæringen til et 15 ml rør og sentrifuge ved 200 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og resuspend cellene i 4 ml friskt medium som inneholder FBS og penicillin/streptomycin. Telle cellene ved hjelp av en automatisk celleteller.
- Frø 1 x 103 celler per cm2 for videre kultur. For eksempel frø 9,5 x 103 celler/brønn for 6-brønnsplater, eller 1,9 x 103 celler/brønn for 24-brønnsplater.
- Inkuber cellene over natten slik at de kan feste seg og gjenopprette, og stimulere deretter MS-1-celler med TGF-β2 i 3 dager. Tilsett TGF-β reseptor kinase inhibitor SB431542 (5 μM) 30 min før TGF-β2 stimulering. Behandle andre celler med kjøretøy (DMSO).
MERK: Løs opp TGF-β2 i 4 mM HCl som inneholder 0,1% humant bovint serumalbumin (BSA). Legg til samme mengde ligandbuffer uten TGF-β2 i kontrollgruppen. TGF-β2-konsentrasjonen kan tilpasses til 0,1-1 ng/ml for spesifikke analyser. Se indikasjoner i tilsvarende tall. - Etter 3 dager, undersøk cellemorfologien med lysfeltavbildning (med et invertert mikroskop) og utfør immunfluorescensfarging (se trinn 2) for å vurdere EndMT-relaterte markørendringer. Utfør minst tre uavhengige eksperimenter for å oppnå biologiske triplikater.
2. Immunfluorescens farging
- Trypsinize dyrket MS-1 celler (trinn 1.2) og deretter reseed 1.9 x 103 celler på en 0.1% m/ v gelatin-belagt 12 mm rundt deksel glass plassert på bunnen av en 24-brønns plate.
- Etter å ha dyrket cellene over natten, legg TGF-β2 (endelig konsentrasjon 1 ng / ml) til cellene i 3 dager. Bruk medium som inneholder ligandbuffer som en negativ kontroll.
- Utfør Pecam-1 og Sm22α farging.
- Etter å ha stimulert cellene med TGF-β2 (eller Kontroll) i 3 dager, fjern mediet og vask cellene med 1x PBS.
- Tilsett 300 μL 4% formaldehyd til hver brønn og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur for å fikse cellene. Vask 3x med 1x PBS etter inkubasjon.
- Tilsett 300 μL 0,1% Triton X-100 i 1x PBS til hver brønn og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur for å permeabilisere cellene. Etter inkubasjon, fjern Triton X-100-løsningen og vask cellene 3x med 1x PBS.
- Blokker cellene med 3% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS i 45 min ved romtemperatur.
- Fortynn de primære Pecam-1- og Sm22α-antistoffene som gjenkjenner murinproteiner 1:500 med 1x PBS. Inkuber deretter de faste cellene med primære antistoffer i 45 min ved romtemperatur.
- Etter å ha vasket 3x med 1x PBS, inkuber cellene med 1000x fortynnede sekundære antistoffer, inkludert esel anti-rotte Alexa 488 og geit anti-kanin Alexa 594, i 45 minutter ved romtemperatur.
MERK: Beskytt prøvene mot lys under farging. - Etter skylling 3x med 1x PBS, plasser dekselglassfrøet med celler med forsiden ned på en dråpe monteringsmedium som inneholder 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) på et lysbilde for å farge kjernene.
- Fest periferien av dekselglasset med gjennomsiktig neglelakk og oppbevar det ved 4 °C.
- Få representative bilder med et konfokalt mikroskop. Still inn laserbølgelengdene på henholdsvis 405 nm, 488 nm og 552 nm for å oppdage HENHOLDSVIS DAPI, Pecam-1 og Sm22α. For hver kanal ble alle bildene tatt med samme innstillinger og eksponeringstid. Utfør minst tre uavhengige eksperimenter for å oppnå biologiske triplikater.
3. Slå ut av sneglen ved hjelp av CRISPR / Cas9-redigering
- Design to uavhengige sgRNAer rettet mot murine Snail.
- Design sgRNAer ved hjelp av online verktøy CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) og Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) i henhold til målrettet gennavn og arter.
- Forutsi off-target aktiviteten til de designede sgRNAene rettet mot Snail med to uavhengige algoritmer, inkludert Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) og CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/).
- Velg to sgRNAer med lavest aktivitet. Design to komplementære sgRNA oligos med Bvejeg kuttet nettstedet. Sansen oligo starter med 5'-ACCG-3'og antisense oligo starter med 5'-AAAC-3'.
- Bestill oligos som skal syntetiseres kommersielt for videre bruk.
- Klone den komplementære guiden RNA oligos inn i BveI-fordøyd AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve I-stuffer Lentiviral vektor plasmid å generereAA19 pLKO.1-Snail-sgRNA16.
- Klipp AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve I-stuffer plasmid med BveIenzymet 16. Bland 2 μg AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve I-stuffer plasmid, 5 μL 10x Buffer O, og 5 μL BveI-enzym og tilsett sterilt vann for å nå et totalt volum på 50 μL.
- Virvel og spinn kort ned reaksjonsblandingen. Inkuber reaksjonen ved 37 °C i 1 time.
- Last reaksjonsblandingen på en 1% agarose gel og kjør i 1x Tris-aceta-EDTA (TAE, 50x TAE-lager: 242 g Tris-base oppløst i vann, 57,1 ml issyre, 100 ml 500 mM EDTA (pH 8,0) oppløsning, og tilsett vann til totalt 1 L) buffer til en god separasjon oppnås.
- Klipp ryggradsfragmentet fra gelen, isoler det med et gelutvinningssett i henhold til produsentens protokoll (se materialtabellen) og elute ryggraden i 40 μL elutionbuffer (EB).
- Bland 5 μL 100 pmol/μL sense oligo og 5 μL 100 pmol/μL antisense oligo med 1 μL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) og tilsett sterilt vann for å nå totalt 100 μL for å anneal gRNA oligos. Inkuber blandingen i 5 min ved 100 °C, og dekk deretter rørene med aluminiumsfolie. Deretter avkjøler du løsningen langsomt til romtemperatur for videre bruk som innsats.
- For å ligate den komplementære gRNA oligos og BveI-fordøyd ryggrad, bland 1 μL isolert Bvejeg kuttet AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-stuffer ryggraden og 2 μL innsats (fortynnet 1:300) med 2 μL av 10x T4 DNA ligase buffer og 1 μL av T4 DNA ligase, sterilt vann for å nå totalt 20 μL. Snurr kort røret, og inkuber det i 4 timer ved romtemperatur for videre bruk.
MERK: Når du utfører ligasjonen, må du sørge for at to kontrollgrupper er inkludert. For en kontrollgruppe blander du 1 μL isolert ryggrad, 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer og 1 μL T4 DNA-ligaer og tilsetter sterilt vann for å nå totalt 20 μL, men uten oligo DNA. For den andre kontrollgruppen blander du 1 μL isolert ryggrad og 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, og tilsett sterilt vann for å nå totalt 20 μL, men uten glødet oligos og T4-ligase. Disse to kontrollforståelsene brukes til å bestemme reaksjonsbakgrunnen i neste transformasjonstrinn og angi hvor effektiv ligaasjonen er.
- Forvandle reaksjonsblandingen til kompetent TOP10 E. coli.
- Samle den kompetente TOP10 E. coli. celler fra -80 °C fryseren, og tine dem på is.
- Tilsett 2 μL ligasjonsblanding til 50 μL kompetente celler og hold røret på is i 30 min.
- Varmsjokk røret ved 42 °C i 30 s. Sett røret på is i 2 min.
- Tilsett 950 μL fersk lysogenybuljong (LB) medium til blandingen og rist kraftig ved 37 °C i 60 minutter.
- Snurr ned og plate cellene på en varm ampicillin (100 μg / ml) motstand LB plate. Inkuber platen ved 37 °C over natten.
- Kontroller vellykket innsetting av gRNA oligos i plasmid.
- Velg 3-5 kolonier på platen i 1 ml ampicillin (100 μg/ml) som inneholder LB medium og rist over natten ved 30 °C.
- Isoler det plasmide DNA-et med et plasmidsett i henhold til produsentens protokoll (Tabell over materialer) og sekvenser det med U6-promotorprimeren 5'- GAGGGCCTATTTCCCATGATT -3' for å bekrefte vellykket innsetting av gRNA-oligo.
4. Generer snegle knockout MS-1 celler
- Produser lentivirale partikler som bærer Cas9 eller Snail-targeting gRNAer.
- Kultur HEK 293T celler i DMEM som inneholder 10% foster bovint serum og 100 U / ml penicillin / streptomycin i 14,5 cm retter (eller T75 kolber) i en inkubator (5% CO2,37 °C).
- Bland 9,9 μg målretting av genplasmid, AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA eller pLV-Cas917 plasmid, sammen med hjelperen plasmider 3,5 μg pCMV-VSVG (koding av G-proteinet til det vesikulære stomatittviruset, VSV-G), 6,6 μg rev-responsive element plasmid pMDLg-RRE (koding Gag og Pol), og 5,0 μg pRSV-REV (koding Rev) i 500 μL serumfritt medium. Resuspend 50 μL polyetylenimin (PEI) (2,5 mg/ml) i 500 μL serumfritt medium. Bland forsiktig plasmider og PEI-preparater ved å pipettere opp og ned. Inkuber blandingen i 20 min ved romtemperatur.
- Transfekt HEK 293T celler ved å legge til blandingsmediet fra trinn 4.1.2 til 80% confluent celler i 14.5 cm retter (eller T75 kolber) som inneholder DMEM medium med 10% FBS og 100 U / ml penicillin / streptomycin. HEK293T-celler brukes fordi de lett blir transfektert og genererer høye nivåer av virus18.
- Overfør transfekterte HEK 293T-celler til en biosikkerhet i mikrobiologisk og biomedisinsk laboratorium (BMBL) for å dyrke dem i 24 timer.
- I et BMBL-laboratorium erstatter du transfeksjonsmediet fra HEK 293T-celler med 12 ml fersk komplett DMEM som inneholder FBS og penicillin/streptomycin. Inkuber cellene i 24 timer.
- Samle og filtrer mediet med en 20 ml sprøyte og et 0,45 μm filter. Overfør det betingede mediet til et 15 ml polypropylenrør.
- Tilsett 12 ml fersk komplett DMEM som inneholder FBS og penicillin/streptomycin til HEK 293T kulturrett og kultur i ytterligere 24 timer.
- Samle og filtrer mediet med en 20 ml sprøyte og et 0,45 μm filter. Overfør det betingede mediet til et 15 ml polypropylenrør. Oppbevar mediet som inneholder lentivirale partikler som 1 ml aliquots ved -80 °C for videre bruk.
- Infiser MS-1-celler med pLV-Cas9-viruset.
- Frø 1 x 105 MS-1 celler per brønn i en 6-brønns plate i 24 timer før lentivirusinfeksjon.
- Tine de frosne aliquots av pLV-Cas9 virus i en 37 °C vannbad.
- Bland 1 ml virusmedium med 1 ml ferskt DMEM-medium som inneholder FBS og penicillin/streptomycin. Tilsett polybren til mediet (sluttkonsentrasjon som 10 μg/ml) for å øke infeksjonseffektiviteten.
- Fjern mediet fra 6-brønnsplaten og erstatt det med viruset / polybrenblandingsmediet og kultur cellene i en inkubator i 24 t. 24 h etter infeksjon, erstatt mediet med friskt medium og kultur cellene i ytterligere 24 timer.
MERK: Hold alltid en uinfoppert brønn og en kontrollgruppe. - Aspirer mediet fra den infiserte gruppen og kontrollgruppen og erstatt det med DMEM-medium med 4 μg /ml blasticidin.
- Returner platen til en 37 °C inkubator og kultur cellene i 1 uke. Uinferte celler vil dø på grunn av effekten av blasticidin. Del de overlevende cellene når de når 80% cellesamtid og fortsett med blasticidin-merket område.
- Bekreft uttrykket av Cas9 i MS-1 celler ved vestlig blotting ved hjelp av et antistoff mot Cas9 (molekylvekten til Cas9 er ca. 160 kDa).
- Infiser pLV-Cas9 MS-1-celler separat med to uavhengige gRNA-lentivirus.
- Frø 1 x 105 pLV-Cas9 MS-1 celler per brønn i en 6-brønns plate i 24 timer før infeksjon.
- Følg samme protokoll som beskrevet i 4.2 for å infisere celler separat med to gRNA-lentivirus.
- Etter 24 timers infeksjon med gRNA-viruset, oppdater mediet og kulturen cellene i ytterligere 24 timer.
- Bytt ut mediet med DMEM med 1 μg/ml puromycin. Returner platen til en 37 °C inkubator og kultur cellene i 1 uke. Forsikre deg om at de uinferte cellene er helt døde. Del cellene når de når 80% samløp og fortsett puromycinvalg.
- Bekreft utslag av snegl i MS-1 celler ved vestlig blotting ved hjelp av et antistoff mot snegl (molekylvekt av snegl er ca. 35 kDa).
Representative Results
TGF-β2 induserer EndMT og stimulerer snegleuttrykk i MS-1 endotelceller
TGF-β er en av cytokinene med størst potensial til å indusere EndMT. Etter å ha behandlet MS-1-celler med TGF-β2 (1 ng/ml) i 3 dager, mister endotelceller sin brosteinlignende struktur og differensierer seg i spindelformede mesenchymale celler (Figur 1A)15. For ytterligere å verifisere rollen som TGF-β2 i induserende celle fenotypiske endringer, forhåndsbehandlet vi cellene med det lille molekylet activin reseptorlignende kinase (ALK)4/ALK5/ALK7-hemmer SB431542 før TGF-β2 stimulering19. SB431542 fullstendig abrogert TGF-β2-indusert cellemorfologi endres (Figur 1A). Den TGF-β2 induserte EndMT-prosessen ble videre undersøkt ved å studere endringer i uttrykket av EndMT-relaterte markører. Som vist i figur 1Bble endotelproteinet Pecam-1 kraftig redusert etter TGF-β2 stimulering, mens den mesenchymale faktoren Sm22α ble dypt oppregulert av TGF-β215. Disse dataene samsvarer med forestillingen om at TGF-β2 utløste EndMT i MS-1-celler. Deretter undersøkte vi effekten av TGF-β2 på snegle- og snegleuttrykk. Som vist i figur 1Cble Snail markert oppregulert av TGF-β2, mens Slug-uttrykket ikke ble påvirket av TGF-β2 i MS-1-cellene15. Kvantifiseringen av snegleuttrykk fra tre uavhengige eksperimenter er vist i figur 1D.
Uttømming av snegl av CRISPR/Cas9 i MS-1 endotelceller
Ettersom Snail ble indusert av TGF-β2 og sannsynligvis involvert i TGF-β2-mediert EndMT, utførte vi CRISPR / Cas9 genredigering for å genetisk tømme snail expression i MS-1 celler. Vi hypoteset at uttømming av snegl ville være tilstrekkelig til å hemme TGF-β2-indusert EndMT. Som vist i figur 2Agenererte vi snegleutslagsceller i to trinn. For det første ble Cas9 ekstopisk uttrykt ved å infisere MS-1-celler med et Cas9 som uttrykte lentivirus. Siden det er en blasticidin motstand kassett i pLV-Cas9-konstruksjonen, sjekket vi uttrykket av Cas9 av vestlig blotanalyse i blasticidinresistente celler (Figur 2D). Deretter introduserte vi sgRNAer som spesifikt målrettet Snail for å forstyrre proteinuttrykket. Denne prosedyren ble også utført ved infeksjon med lentivirale partikler som bærer AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA-konstruksjonen, som inkluderer en puromycinuttrykkskassett. Cas9-uttrykkende celler ble igjen smittet med gRNA som inneholder lentivirus og videre valgt med puromycin. To komplementære sgRNA oligos rettet mot murine Snail ble designet med en spådd lav off-target aktivitet (Figur 2B, C). Etter å ha introdusert to uavhengige snegle sgRNAer i Cas9 uttrykker MS-1 celler, Snegl protein uttrykk ble abrogated (Figur 2D)15.
Mangel på snegl hemmer TGF-β2-indusert EndMT i MS-1 celler
For å demonstrere funksjonen til Snail i TGF-β2-mediert EndMT, utførte vi en EndMT-analyse i sneglearmede celler og sammenlignet den med foreldre MS-1-celler. Som vist i figur 3A, var utslag av snegl tilstrekkelig til å hemme fibroblastlignende cellemorfologi drevet av TGF-β2 i MS-1 celler15. I tillegg ble TGF-β2-mediert nedgang i Pecam-1 og forbedring av Sm22α fullstendig blokkert i Snegle-utarmede MS-1-celler. Oppsummert demonstrerte vi at Snail er kritisk for TGF-β2-mediert EndMT i MS-1 celler (Figur 3B)15.
Figur 1. TGF-β2 induserer EndMT- og Snail-uttrykk i MS-1-celler. A. Effekter av TGF-β2 og/eller TGF-β type I reseptor kinase inhibitor SB-431542 på cellemorfologi. Brightfield-bilder av MS-1-celler ved behandling med TGF-β2 (1 ng/ml) og/eller SB-431542 (SB, 5 μM, administrert 30 min før TGF-β2) i 2 dager. Skalalinjen representerer 200 μm. B. Immunfluorescensfarging av Pecam-1 (grønn) og Sm22α (rød) i MS-1 celler dyrket i medium som inneholder TGF-β2 (1 ng/ml) i 3 dager. Kjerner visualiseres i blått (DAPI). Skala bar: 50 μm. C. Vestlig flekk med hele celle lysate av TGF-β2 stimulert MS-1 celler. Uttrykket av Snail, men ikke Slug, ble forbedret av TGF-β2 stimulering, som tidligere rapportert i Ma et al15. D. Kvantifisering av snegleuttrykk ved å integrere resultatene fra tre uavhengige vestlige bloteksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Uttømming av snegl ved CRISPR-Cas9 genredigering. A. Ordning som viser hvordan du genererer snegle knockout celler. Bsd: Blasticidin. Puro: Puromycin. B. Oligonukleotider av to uavhengige sgRNAer rettet mot snegl ved hjelp av CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) og Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). C. Den anslåtte off-target aktiviteten til de to gRNAene for snegl ved hjelp av Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). D. Cas9 og Snail uttrykk i wild type (WT) og Cas9-overekspressert MS-1 målt ved vestlig blot analyse. E. Knockout av snegl med to uavhengige gRNAer i MS-1 celler målt ved vestlig blot analyse. Vi rapporterte lignende resultater i Ma et al15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Genetisk uttømming av snegl hemmer TGF-β2-indusert EndMT i MS-1 celler. A. Brightfield bilder av MS-1 celler ved behandling med TGF-β2 (0.1 ng/ml) i 3 dager i wildtype (WT, øvre panel) og Snail slått ut (nedre panel) celler. Skalastang representerer 200 μm. B. Immunfluorescent farging for Pecam-1 (grønn), Sm22α (rød) og kjerner (blå) av MS-1 celler dyrket i medium som inneholder TGF-β2 (1 ng/ml) i 3 dager. Uttømming av snegl abrogated TGF-β2-indusert reduksjon av Pecam-1 og økning av Sm22α uttrykk. Skalalinjen representerer 50 μm. C. Skjematisk representasjon av effekten av snegleutstansing på TGF-β-indusert EndMT i MS-1-celler. TGF-β stimulerer uttrykket snegl gjennom Smadbanen ved å fosfori Smad2/3 og videre driver EndMT. Slår ut snegl ved hjelp av CRISPR /Cas9-basert genredigering abrogated TGF-β-mediert EndMT. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Å forstå mekanismen til EndMT er avgjørende for å modulere denne prosessen og målrette EndMT-relaterte sykdommer. Her beskrev vi metoder for å utføre en TGF-β-indusert EndMT-analyse og forhøre rollen som EndMT-TF Snail i TGF-β-utløst EndMT, ved å utføre CRISPR / Cas9-mediert stabil genuttømming av snegl fra celler. Uttømmingen av sneglen ved hjelp av CRISPR/Cas9-tilnærming vellykket abrogated TGF-β2 drevet EndMT i MS-1 celler (Figur 3C). For å studere effekten av cytokiner, som TGF-β, på EndMT, ble ECs utsatt for cytokiner, og deretter ble forekomsten av EndMT vurdert i henhold til morfologiske endringer og endotel- og mesenchymale markøruttrykksendringer i celler. TGF-β2 sterkt indusert EndMT i MS-1 celler ledsaget av en sterk økning i uttrykket av transkripsjonsfaktoren Snail. EndMT-TF-ene indusert av TGF-β kan variere i henhold til arten eller vevsspesifikk endotelcelletype. For eksempel observerte vi at Snail, men ikke Slug ble betydelig oppregulert av TGF-β i MS-1-celler, mens i humane navlestrengsbentelceller (HUVECs) økes både snegl og slug etter eksponering for TGF-β20.
Vi vurderte omfanget av EndMT-prosessen på to måter ved å undersøke cellemorfologiendringer og deretter ved å undersøke endringer i EndMT-relaterte markører uttrykk. Etter TGF-β eksponering i 3 dager gjennomgikk cellene EndMT med konsistente morfologiske variasjoner og endringer i uttrykket av EndMT-relaterte markører. I tillegg til immunfluorescensfargingen vi utførte her, kan markørvariasjoner også overvåkes av vestlig blotting på proteinuttrykksnivå eller ved qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR) på gennivåene21. I tillegg til disse to tids- og kostnadsbesparende metodene som vi viste i denne protokollen, er det andre metoder for å undersøke EndMT. Hvis du for eksempel utfører transkripsjonsanalyse (ved RNA-sekvensering eller qPCR) for å sammenligne uttrykksnivåene til endotel- og mesenchymale relaterte gener mellom behandlede og kontrollceller, kan de nøyaktig vurdere EndMT22,23. I tillegg innebærer EndMT ofte stabil tap av barrierefunksjon, som kan vurderes ved impedansspektroskopi24. Videre kan ytterligere bevis på oppkjøpet av stamcellelignende egenskaper av EndMT-avledede celler undersøkes. For eksempel, under spesifikke kulturforhold, kan EndMT mesenchymal-lignende celler ytterligere differensieres til osteoblaster, kondrocytter, adipocytter eller (myo)fibroblaster. Derfor er ytterligere analyse for å bekrefte differensiering i forskjellige celletyper som tilhører mesoderm-avstamningen (dvs. genuttrykk og matrisefarging) nyttig for å demonstrere den multipotente naturen til EndMT-avledede celler. Til slutt er EndMT-vurderingsmetodene ikke begrenset til in vitro-studier, men kan ekstrapoleres for å undersøke forholdet mellom EndMT og noen sykdommer in vivo eller i ex vivo-organer. I denne forstand utvides bruken av endotelspesifikke linjesporingsstrategier bredt til EndMT-relatert forskning25.
For å undersøke sneglens rolle under EndMT, ble CRISPR/Cas9 genredigering i denne studien brukt til å slå ut dette genet. Dataene viste at TGF-β2 ikke klarte å megle EndMT i Sneglemangel MS-1 celler. Denne observasjonen viste at Snegl er avgjørende for TGF-β2 indusert EndMT i MS-1 celler. Vi brukte en uavhengig U6-drevet sgRNA-uttrykkskassett for å introdusere spesifikke sgRNAer for Cas9 for å målrette sneglen. I tillegg til denne metoden beskrev Ran et al.26 en annen strategi for kloning av sgRNA oligos-sekvensen i Cas9-stillaset for å generere en konstruksjon som inneholder både Cas9 og gRNAer. Nye nye tilnærminger gjør det mulig for CRISPR/Cas å innlemme tilleggsfunksjoner. Dobbelt- eller trippelutstansing kan for eksempel oppnås ved å levere flere sgRNAer i celler som uttrykker Cas927. Den konstruerte Cas13 protein mål og fordøyer RNA molekyler uten å forstyrre endogene DNA28. I tillegg til å slå ut gener med CRISPR/Cas, kan korte hårnåls-RNAer (shRNAer) brukes som alternativer for å slå ned målrettet genuttrykk29. For alle CRISPR/Cas genredigeringsmetoder bør det alltid tas hensyn til off-target spalting. I tillegg fortynnes små forstyrrende RNAer (siRNAer) forbigående stille genuttrykk og siRNA-konsentrasjonen fortynnes med celledeling30. Begge disse metodene undertrykker delvis målrettet genuttrykk. I motsetning til dette brukes ektopisk genuttrykk også til å verifisere genfunksjonen under EndMT/EMT31. Denne tilnærmingen kan avgjøre om oppreguleringen av et gen er tilstrekkelig til å fremkalle en EndMT-respons. Derfor er det for tiden en rekke tekniske strategier som kan brukes til å identifisere og verifisere potensielle regulatorer i EndMT. Dessuten kan transkripsjonsanalyse være et godt alternativ i identifisering og omfattende analyse av EndMT-relaterte regulatorer. Vi anbefaler å bruke forskjellige komplementære tilnærminger for å undersøke moduleringen av EndMT.
Oppsummert introduserte vi en arbeidsflyt for å identifisere faktorer som kan spille funksjonelle roller under TGF-β-indusert EndMT. Denne metoden kan også brukes til å studere om andre stimuli (dvs. cytokiner, vekstfaktorer, mekaniske stimuli, cellecelleinteraksjoner) kan modulere EndMT, og samspillet mellom TGF-β med andre stimuli. I tillegg fremhevet vi en tilnærming ved hjelp av CRIPSR/Cas genredigering for å belyse om et bestemt gen er nødvendig for TGF-β-indusert EndMT. For å illustrere denne metodikken brukte vi den sterke EndMT-induseren TGF-β2 i MS-1-celler, men protokollene kan tilpasses andre cytokiner og andre celletyper. Vi forventer at denne detaljerte protokollen som beskrives vil fungere som et springbrett for fremtidige EndMT-relaterte studier.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskningen ble støttet av CGC.NL og Nederland Cardio Vascular Research Initiative: Dutch Heart Foundation, Dutch Federation of University Medical Centers, Nederland Organization for Health Research and Development og Royal Netherlands Academy of Sciences Grant tildelt Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM støttes av det kinesiske stipendrådet. GSD støttes av et Trampoline-stipend fra AFM-Telethon [22379], FOP Italia og et stipend fra La Fundació La Marató de TV3 (#202038).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
| 10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
| 12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
| 20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
| AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
| Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
| Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
| Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
| Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
| Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
| Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
| BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
| Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
| Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
| LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
| MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
| Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
| PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
| PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
| Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
| Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
| TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
| Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
| Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
| Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |
References
- Ma, J., Sanchez-Duffhues, G., Goumans, M. -J., Ten Dijke, P. TGF-β-induced endothelial to mesenchymal transition in disease and tissue engineering. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Piera-Velazquez, S., Jimenez, S. A. Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases. Physiological Reviews. 99 (2), 1281-1324 (2019).
- Sánchez-Duffhues, G., de Vinuesa, G. A., ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. 247 (3), 492-508 (2018).
- Evrard, S. M., et al. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nature Communications. 7 (1), 1-16 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Clere, N., Renault, S., Corre, I.
- Saito, A. EMT and EndMT: regulated in similar ways. The Journal of Biochemistry. 153 (6), 493-495 (2013).
- Bolós, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. Journal of Cell Science. 116 (3), 499-511 (2003).
- Aird, W. C.
- Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-12 (2020).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Arbiser, J. L., et al. Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 94 (3), 861-866 (1997).
- MA, J., et al. TGF-?-induced endothelial to mesenchymal transition results from a balance between SNAIL and ID factors. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 182 (9), (2021).
- Chen, X., et al. Probing the impact of chromatin conformation on genome editing tools. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6482-6492 (2016).
- Hunter, F. W., et al. Functional CRISPR and shRNA screens identify involvement of mitochondrial electron transport in the activation of evofosfamide. Molecular Pharmacology. 95 (6), 638-651 (2019).
- Mao, Y., et al. Lentiviral vectors mediate long-term and high efficiency transgene expression in HEK 293T cells. International Journal of Medical Sciences. 12 (5), 407 (2015).
- Liu, S., et al. Deubiquitinase activity profiling identifies UCHL1 as a candidate oncoprotein that promotes TGFβ-induced breast cancer metastasis. Clinical Cancer Research. 26 (6), 1460-1473 (2020).
- Medici, D., et al. Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells. Nature Medicine. 16 (12), 1400 (2010).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFβ-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Dong, J., et al. Single-cell RNA-seq analysis unveils a prevalent epithelial/mesenchymal hybrid state during mouse organogenesis. Genome Biology. 19 (1), 1-20 (2018).
- Oatley, M., et al. Single-cell transcriptomics identifies CD44 as a marker and regulator of endothelial to haematopoietic transition. Nature communications. 11 (1), 1-18 (2020).
- Halaidych, V., et al. Inflammatory responses and barrier function of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (5), 1642-1656 (2018).
- Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Grav, L. M., et al. One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnology Journal. 10 (9), 1446-1456 (2015).
- Abudayyeh, O. O., et al.
- Paddison, P. J., et al. Cloning of short hairpin RNAs for gene knockdown in mammalian cells. Nature Methods. 1 (2), 163-167 (2004).
- Reynolds, A., et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology. 22 (3), 326-330 (2004).
- Lourenço, A. R., et al. C/EBPɑ is crucial determinant of epithelial maintenance by preventing epithelial-to-mesenchymal transition. Nature Communications. 11 (1), 1-18 (2020).
