Endotel hücrelerinde TGF-β2 kaynaklı EndMT’yi araştırmak için hücre morfolojisi değişikliklerini gözlemleyerek ve immünofluoresans boyama kullanarak EndMT ile ilgili belirteç değişiklikleri ifadesini inceleyerek yöntemleri açıklıyoruz. CRISPR/Cas9 gen düzenlemesi, TGF-β2 kaynaklı EndMT’deki rolünü araştırmak için gen kodlama Salyangozunu tükenmek için tanımlanmış ve kullanılmıştır.
Belirli dış ipuçlarına ve belirli transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonuna yanıt olarak, endotel hücreleri mezenkimal geçişe (EndMT) endotel olarak verilen bir işlem olan mezenkimal benzeri bir fenotipe dönüşebilir. Ortaya çıkan sonuçlar, EndMT’nin fibrozis ve kanser gibi birden fazla insan hastalığıyla nedensel olarak bağlantılı olduğunu ileri sürmektedir. Ek olarak, endotel türevi mezenkimal hücreler doku rejenerasyon prosedürlerinde uygulanabilir, çünkü çeşitli hücre tiplerine (örneğin, osteoblastlar ve kondrositler) daha da ayırt edilebilirler. Bu nedenle, EndMT’nin seçici manipülasyonu klinik potansiyele sahip olabilir. Epitel-mezenkimal geçiş (EMT) gibi, EndMT, Salyangoz ve Sümüklüböcek de dahil olmak üzere EndMT transkripsiyon faktörlerinin (EndMT-TF) ekspresyonunu uyaran salgılanan sitokin dönüşüm büyüme faktörü-beta (TGF-β) tarafından güçlü bir şekilde indüklenebilir. Bu EndMT-TF’ler daha sonra sırasıyla mezenkimal ve endotel proteinlerinin seviyelerini yukarı ve aşağı doğru düzenler. Burada, TGF-β kaynaklı EndMT in vitro’yu araştırma yöntemlerini, belirli TF’lerin TGF-β kaynaklı EndMT’deki rolünü incelemek için bir protokol de dahil olmak üzere açıklıyoruz. Bu teknikleri kullanarak, TGF-β2’nin murine pankreas mikrovasküler endotel hücrelerinde (MS-1 hücreleri) EndMT’yi uyardığı ve düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) aracılı gen düzenleme kullanılarak Salyangozun genetik tükenmesinin bu fenomeni yok ettiğine dair kanıtlar sunuyoruz. Bu yaklaşım, endotel biyolojisinin potansiyel modülatörlerini sorgulamak için bir model görevi görebilir ve insan hastalığında potansiyel uygulama ile EndMT’nin yeni düzenleyicilerini tanımlamak için genetik veya farmakolojik ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilir.
Endotelden mezenkimal geçişe (EndMT), çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlere bağlanmış çok yönlü ve dinamik bir biyolojik olgudur1,2. EndMT endotel hücreleri yavaş yavaş endotel özelliklerini kaybederken, mezenkimal özelliklerelde ederken 3; böylece, sıkıca sıkıştırılmış ve iyi organize edilmiş endotel hücreleri uzun mezenkimal benzeri hücrelere ayırır. EndMT’deki morfolojik değişiklikler, bazı genlerin ve proteinlerin ekspresyonunda değişikliklerle çakışmaktadır. Genel olarak, vasküler endotel (VE)-cadherin, trombosit/EC yapışma molekülü-1 (CD31/Pecam-1) dahil olmak üzere endotel özelliklerini koruyan proteinlerin ekspresyonu azalır. Aynı zamanda, α-düz kas aktisin (α-Sma) ve düz kas proteini 22α (Sm22α) gibi mezenkimal fonksiyonlarla ilgili proteinler birikir. Ortaya çıkan sonuçlar, postnatal EndMT’nin kanser, kardiyak fibrozis, pulmoner arteriyel hipertansiyon (PAH), ateroskleroz (AS), organ fibrozisvb. EndMT’nin temel mekanizmalarının ve EndMT sürecinin nasıl yönlendirılacağının daha derin bir şekilde anlaşılması, EndMT ile ilgili hastalıklar ve rejeneratif tıp için yeni terapötik yöntemler sağlayacaktır.
TGF-β ana EndMT indükleyicilerinden biridir ve bilinen diğer ilgili faktörler arasında Wnt / β-catenin, Çentik ve bazı enflamatuar sitokinler1bulunur. Hücresel bağlam, TGF-β tarafından tetiklenen yanıtlar için anahtar olduğundan, TGF-β diğer EndMT tanıtım sinyalleriyle etkileşimi, TGF-β’ın endmt yanıtı ortaya çıkarmak için uygun olmasıdır. TGF-β hücre yüzey tipi I ve tip II serine/threonine kinaz reseptörlerinin aktivasyonu üzerine hücre içi kanonik Smad yolu aktive edilir. TGF-β reseptör aracılı fosforilasyonlu Smad2/3, Smad4 ile çekirdeğe yerleştiği heteromerik kompleksler oluşturur ve burada EndMT ile ilgili transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu yükseltirler. Epitel-mezenkimal geçişe (EMT) benzer şekilde, Salyangoz, Sümüklüböcek, Twist, Zeb1 ve Zeb2 gibi transkripsiyon faktörleri TGF-β sinyali ile indüklenir ve EndMT8’degen yeniden programlanmasına katkıda bulunur.
Salyangoz, EndMT’de sıklıkla önemli bir faktör olarak tanımlanmıştır. Salyangoz, hücre-hücre yapışıklık proteinlerini kodlayan genlerin promotörüne bağlanır ve mezenkimal proteinlerin ekspresyonunun arttırılmasıyla dengelenen transkripsiyonlarını bastırır9. Endotel hücreleri çok heterojen bir popülasyondan oluşur ve çeşitli hücre dışı uyaranların EndMT üzerindeki göreceli etkisi endotel hücresel bağlamları veya hücre tipleri arasında farklılık gösterebilir10. EMT ile benzerlikleri nedeniyle, bazı metodolojiler emt ve EndMT8her iki mekanizmayı araştırmak için yararlıdır. Bu bağlamda, EMT International Association (TEMTIA), EMT/ EndMT11’inoluşumunu nihayetinde göstermek için tamamlayıcı tekniklere duyulan ihtiyacı güçlü bir şekilde vurgulamaktadır.
Burada, TGF-β kaynaklı EndMT sürecini izlemek ve görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz. İmmünofluoresans lekeleme, EndMT işleminin gerçekleşip gerçekleşmediğinin göstergesi olarak kullanılan hedeflenen protein/belirteçlerdeki ifade değişiklikleri hakkında temel bilgileri sağlar. Ek olarak, immünofluoresans lekelenmesi proteinlerin / belirteçlerin lokalizasyonunu ve hücre morfolojisini görselleştirebilir. TGF-β aracılı EndMT’de yer alan belirli TF’lerin (veya diğer yukarı veya aşağı akış düzenleyicilerinin) potansiyel aktivitesini incelemek için, örnek olarak TF Salyangozunu kullanarak hücrelerden belirli genleri tükenmek için kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) /CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) gen düzenlemesini kullanan bir protokol açıklıyoruz. Cas9, bakterilerde CRISPR dizilerini tamamlayıcı olarak tanıyan ve parçalayan çift RNA güdümlü DNA endonuclease12. CRISPR/Cas9 sistemi şu anda yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü genetik mühendisliğini in vitro ve in vivo13kolaylaştırır. Tek bir kılavuz RNA (sgRNA) tarafından yönetilen ektopik olarak ifade edilen Cas9, belirli bir gen lokusunda önceden belirlenmiş bir hedefleme dizisinde çift iplikçik kırılması oluşturur. Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), rastgele nükleotid eklemeleri veya silmeleri yoluyla Cas9 kaynaklı iplikçik kırılmalarını onarmak ve böylece hedeflenen genin bozulmasına ve inaktivasyonuna yol açmak için gerçekleşir. Seçici sgRNA’lar tasarlamak ve tasarlanmış sgRNA’ları içeren lentiviral uyumlu vektörler üretmek için ayrıntılı yöntemler açıklıyoruz. Sonuç olarak, gen tükenmiş stabil endotel hücreleri verimli ve güvenilir bir şekilde üretilebilir.
Bu çalışmada TGF-β2 kaynaklı EndMT sürecini incelemek için model sistem olarak murine pankreas mikrovasküler endotel hücreleri (MS-1)14’ü kullandık. Önceki çalışmamız Salyangozun, MS-1 hücrelerinde EndMT’nin indüklediği TGF-β2 tarafından artırılan ana transkripsiyon faktörü olduğunugöstermiştir 15. CRISPR/Cas9 gen düzenlemesi ile MS-1 hücrelerindeki Salyangoz ekspresyonunu yok eden TGF-β2, EndMT’ye aracılık edemedi. Bu iş akışı, EndMT ile ilgili diğer (şüpheli) genleri incelemek için uygulanabilir.
EndMT mekanizmasını anlamak, bu sürecin modülei ve EndMT ile ilgili hastalıkların hedeflenesi için kritik öneme sahiptir. Burada, TGF-β kaynaklı endmt tahlili yapmak ve TGF-β tetiklenen EndMT’de EndMT-TF Salyangozunun rolünü sorgulamak için crispr/cas9 aracılı hücrelerden salyangozun stabil gen tükenmesini gerçekleştirerek yöntemleri tanımladık. CRISPR/Cas9 yaklaşımı kullanılarak salyangozun tükenmesi, MS-1 hücrelerinde TGF-β2 tahrikli EndMT’i başarıyla bozuyor (Şekil 3C). TGF-β gibi herhangi bir sitokinin EndMT üzerindeki etkilerini incelemek için, VC’ler sitokinlere maruz kaldı ve daha sonra EndMT oluşumu morfolojik değişikliklere ve hücrelerdeki endotel ve mezenkimal belirteç ifade değişikliklerine göre değerlendirildi. TGF-β2, TRANSKRIPSiyon faktörü Salyangoz ekspresyonunda güçlü bir artış eşliğinde MS-1 hücrelerinde EndMT’ye güçlü bir şekilde indüklenmiş. TGF-β tarafından indüklenen EndMT-TF’ler türe veya dokuya özgü endotel hücre tipine göre farklılık gösterebilir. Örneğin, Salyangoz ama Sümüklüböcek’in MS-1 hücrelerinde TGF-β tarafından önemli ölçüde yukarı doğru ayarlandığını, insan göbek damarı endotel hücrelerinde (HUVEC) ise TGF-β20’yemaruz kaldıktan sonra hem Salyangoz hem de Sümüklüböcek arttığını gözlemledik.
EndMT sürecinin kapsamını hücre morfolojisi değişikliklerini inceleyerek ve daha sonra EndMT ile ilgili belirteçler ifadesindeki değişiklikleri araştırarak iki şekilde değerlendirdik. 3 gün boyunca TGF-β maruz kaldıktan sonra, hücrelere EndMT ile ilgili belirteçlerin ifadesinde tutarlı morfolojik varyasyonlar ve değişiklikler yapıldı. Burada gerçekleştirdiğimiz immünofluoresans lekelemesine ek olarak, marker varyasyonları protein ekspresyon seviyesinde batı şişkinliği veya gen seviyelerinde qRT-PCR (Gerçek Zamanlı Nicel Ters Transkripsiyon PCR) ile de izlenebilir21. Bu protokolde gösterdiğimiz bu iki zaman ve maliyet tasarrufu yöntemine ek olarak, EndMT’yi incelemek için başka yöntemler de vardır. Örneğin, tedavi edilen ve kontrol hücreleri arasındaki endotel ve mezenkimal ile ilgili genlerin ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak için transkriptom analizi (RNA dizilimi veya qPCR ile) yapmak EndMT22,23‘ühassas bir şekilde değerlendirebilir. Ek olarak, EndMT genellikle empedans spektroskopisi24ile değerlendirilebilen bariyer fonksiyonunun kararlı kaybını içerir. Ayrıca, EndMT türevi hücreler tarafından kök hücre benzeri özelliklerin elde edildiğine dair ek kanıtlar incelenebilir. Örneğin, belirli kültür koşullarında, EndMT mezenkimal benzeri hücreler osteoblastlara, kondrositlere, adipositlere veya (myo)fibroblastlara daha da ayırt edilebilir. Bu nedenle, mezoderm soyuna ait farklı hücre tiplerine farklılaşmayı doğrulamak için ek analiz (yani gen ekspresyonu ve matris boyama) EndMT türevi hücrelerin çokpotent doğasını göstermek için yararlıdır. Son olarak, EndMT değerlendirme yöntemleri in vitro çalışmalarla sınırlı değildir, ancak EndMT ile bazı hastalıklar arasındaki ilişkiyi vivo veya ex vivo organlarda araştırmak için tahmin edilebilir. Bu anlamda, endotel spesifik soy izleme stratejilerinin kullanımı EndMT ile ilgili araştırmaya geniş ölçüde genişletilmiştir25.
EndMT sırasında Salyangozun rolünü araştırmak için, bu çalışmada CRISPR/Cas9 gen düzenlemesi bu geni nakavt etmek için kullanılmıştır. Veriler, TGF-β2’nin salyangoz eksikliği MS-1 hücrelerinde EndMT’ye aracılık edemediğini gösterdi. Bu gözlem, SALYANGOZ’un MS-1 hücrelerinde TGF-β2 indüklenen EndMT için gerekli olduğunu göstermiştir. Cas9’un Salyangozu hedeflemesi için belirli sgRNA’ları tanıtmak için bağımsız bir U6 tahrikli sgRNA ifade kaseti kullandık. Bu yönteme ek olarak, Ran ve ark.26, hem Cas9 hem de gRNA’ları içeren bir yapı oluşturmak için sgRNA oligos dizisini Cas9 iskelesine klonlamak için başka bir strateji tanımladı. Ortaya çıkan yeni yaklaşımlar CRISPR/Cas’ın ek işlevler içermesine olanak sağlar. Örneğin, Cas927‘yi ifade eden hücrelere daha fazla sgRNA teslim ederek çift veya üçlü nakavtlar elde edilebilir. Tasarlanan Cas13 proteini, endojen DNA28’ibozmadan RNA moleküllerini hedefler ve sindirir. CRISPR/ Cas ile genleri nakavt etmenin yanı sıra, kısa saç tokası RNA’ları (shRNA’lar) hedeflenen gen ekspresyonunu saptanmak için alternatif olarak kullanılabilir29. Tüm CRISPR/Cas gen düzenleme yöntemleri için hedef dışı bölünme her zaman göz önünde bulundurulmalıdır. Ek olarak, küçük müdahaleci RNA’lar (siRNA’lar) gen ekspresyonını geçici olarak susturur ve siRNA konsantrasyonu hücre bölünmesi30ile seyreltilir. Her iki yöntem de hedeflenen gen ekspresyonlarını kısmen bastırır. Buna karşılık, EndMT/EMT31sırasında gen fonksiyonunu doğrulamak için ektopik gen ekspresyonu da kullanılır. Bu yaklaşım, bir genin yukarıgülasyonunun endmt yanıtı vermek için yeterli olup olmadığını belirleyebilir. Bu nedenle, şu anda EndMT’nin potansiyel düzenleyicilerini tanımlamak ve doğrulamak için kullanılabilecek çok sayıda teknik strateji vardır. Ayrıca, transkriptomik analiz EndMT ile ilgili düzenleyicilerin tanımlanmasında ve kapsamlı analizinde iyi bir seçenek olabilir. EndMT modülasyonunu araştırmak için farklı tamamlayıcı yaklaşımlar kullanmanızı öneririz.
Özetle, TGF-β kaynaklı EndMT sırasında işlevsel roller oynayabilecek faktörleri belirlemek için bir iş akışı sunduk. Bu yöntem, diğer uyaranların (örneğin sitokinler, büyüme faktörleri, mekanik uyaranlar, hücre-hücre etkileşimleri) EndMT’yi modüle edip edemeyebileceğini ve TGF-β diğer uyaranlarla etkileşimini incelemek için de kullanılabilir. Buna ek olarak, TGF-β kaynaklı EndMT için belirli bir genin gerekli olup olmadığını ortaya çıkarmak için CRIPSR/Cas gen düzenlemesini kullanarak bir yaklaşımı vurguladık. Bu metodolojiyi göstermek için MS-1 hücrelerinde güçlü EndMT indükleyici TGF-β2’yi kullandık, ancak protokoller diğer sitokinlere ve diğer hücre tiplerine uyarlanabilir. Açıklanan bu detaylı protokolün gelecekteki EndMT ile ilgili çalışmalar için bir basamak görevi göreceğiz.
The authors have nothing to disclose.
Araştırma CGC.NL ve Hollanda Kardiyo Vasküler Araştırma Girişimi tarafından desteklendi: Hollanda Kalp Vakfı, Hollanda Üniversite Tıp Merkezleri Federasyonu, Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Örgütü ve Phaedra-Impact’e (http://www.phaedraresearch.nl) verilen Hollanda Kraliyet Bilimler Akademisi Hibesi. JM, Çin Burs Konseyi tarafından desteklenmektedir. GSD, AFM-Telethon [22379], FOP Italia’dan Trambolin hibesi ve La Fundació La Marató de TV3’ten (#202038) bir hibe ile desteklenmektedir.
0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |