당사는 세포 형태 변화를 관찰하고 면역형성 염색을 이용한 발현 EndMT 관련 마커 변경을 검사함으로써 내피 세포에서 TGF-β2 유도 EndMT를 조사하는 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 유전자 편집은 TGF-β2 유도 EndMT에서의 역할을 조사하기 위해 달팽이를 코딩하는 유전자를 고갈시키기 위해 기술및 사용되었다.
특정 외부 단서 및 특정 전사 인자의 활성화에 응하여, 내피 세포는 중간엽 과 같은 표현형, 중간엽 전이(EndMT)에 내피성이라고 불리는 과정으로 분화할 수 있다. 신흥 결과는 EndMT가 섬유증과 암과 같은 다중 인간 적인 질병에 인과관계가 있다는 것을 건의했습니다. 또한, 내피 유래 중간엽 세포는 조직 재생 절차에 적용될 수 있으며, 다양한 세포 유형(예를 들어, 골세포 및 연골세포)으로 더 분화될 수 있다. 따라서, EndMT의 선택적 조작은 임상 잠재력을 가질 수 있다. 상피-중간엽 전이(EMT)와 마찬가지로 EndMT는 달팽이 및 슬러그를 포함한 소위 EndMT 전사 인자(EndMT-TFs)의 발현을 자극하는 분비된 사이토카인 변환 성장 인자-베타(TGF-β)에 의해 강하게 유도될 수 있다. 이러한 EndMT-TFs는 각각 중간엽 및 내피 단백질의 수준을 상하 조절합니다. 여기서, 우리는 TGF-β 유도된 EndMT를 시험관내에서 조사하는 방법을 설명하며, TGF-β 유도된 EndMT에서 특정 TF의 역할을 연구하는 프로토콜을 포함한다. 이러한 기술을 이용하여, TGF-β2가 뮤린 췌장 내피 세포(MS-1 세포)에서 EndMT를 자극하고, 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9(Cas9)를 매개한 유전자 편집을 사용하여 달팽이의 유전고갈약이 이 현상을 분석한다는 증거를 제공합니다. 이 접근법은 내피 생물학의 잠재적인 변조기를 심문하는 모형으로 봉사할 수 있고, 인간 적인 질병에 있는 잠재적인 응용으로 EndMT의 새로운 레귤레이터를 확인하기 위하여 유전 또는 약리학적인 스크린을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다.
중간엽 전이(EndMT)에 내피는 다양한 생리학적 및 병리학적 과정1,2에연결된 다단계 및 동적 생물학적 현상이다. EndMT 내피 세포는 중간 엽 특성3을획득하면서 점차적으로 내피 특성을 잃습니다. 따라서, 단단히 압축되고 잘 조직된 내피 세포는 길쭉한 중간엽 같이 세포로 분화합니다. EndMT의 형태학적 변화는 특정 유전자와 단백질의 발현의 변화와 일치합니다. 일반적으로, 혈관 내피(VE)-카데린, 혈소판/EC 접착 분자-1(CD31/Pecam-1)을 포함하는 내피특성을 유지하는 단백질의 발현이 감소한다. 동시에, α-부드러운 근육 액틴(α-Sma) 및 부드러운 근육 단백질(22α)과 같은 중간엽 기능과 관련된 단백질이 축적된다. 신생아 후 엔드MT가 암, 심장 섬유증, 폐 동맥 고혈압 (PAH), 죽상 동맥 경화증 (AS), 장기 섬유증 등2,4,5,6,7과같은 인간 질환의발달에기여한다는 것을입증했습니다. EndMT의 기본 메커니즘과 EndMT 프로세스를 지시하는 방법에 대한 심층적인 이해는 EndMT 관련 질병 및 재생 의학에 대한 새로운 치료 방법을 제공 할 것입니다.
TGF-β 주요 EndMT 유도제 중 하나이며, 다른 알려진 관련 요인은 Wnt/β-카테닌, 노치 및 일부 염증성 사이토카인1을포함한다. 세포 컨텍스트는 TGF-β 의해 트리거 응답에 대 한 키, 다른 EndMT 홍보 신호와 TGF-β 상호 작용은 TGF-β 대 한 EENDMT 응답을 유도 하는 관련. TGF-β 세포 표면 유형 I 및 타입 II 세린/threonine 키나아제 수용체의 활성화시, 세포내 정경성 스마드 통로가 활성화된다. TGF-β 수용체 매개 인은 Smad2/3 형태의 이종복합체를 핵으로 배회하여 EndMT 관련 전사 인자의 발현을 조절합니다. 상피-중간엽 전이(EMT)와 유사하게, 달팽이, 슬러그, 트위스트, Zeb1 및 Zeb2와 같은 전사 인자는 TGF-β 신호에 의해 유도되고 EndMT8에서유전자 재프로그래밍에 기여한다.
달팽이는 EndMT의 핵심 요소로 자주 확인되었습니다. 달팽이는 세포 세포 접착 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터에 결합하고 중간엽 단백질9의발현의 향상에 의해 균형을 이루는 그들의 전사를 억제합니다. 내피 세포는 매우 이질적인 집단을 포함하고 EndMT에 대한 다양한 세포 외 자극의 상대적 영향은 내피 세포 맥락 또는 세포유형(10)과다를 수 있다. EMT와의 유사성으로 인해 일부 방법론은 EMT 및 EndMT8메커니즘을 모두 조사하는 데 유용합니다. 이와 관련하여 EMT 국제협회(TEMTIA)는 EMT/EndMT11의발생을 궁극적으로 입증하기 위한 보완 기술의 필요성을 강력히 강조하고 있다.
여기서는 TGF-β 유도된 EndMT 프로세스를 모니터링하고 시각화하는 방법을 설명합니다. 면역 형광 염색은 EndMT 프로세스가 일어나는지 여부의 지표로 사용되는 표적 단백질 / 마커의 발현 변화에 대한 기본 정보를 제공합니다. 추가적으로, 면역 형광 염색은 단백질/마커 및 세포 형태학의 현지화를 시각화할 수 있습니다. TGF-β 중재 된 EndMT에 관여하는 특정 TFs (또는 다른 업스트림 또는 다운스트림 레귤레이터)의 잠재적 인 활성을 연구하기 위해, 우리는 정기적으로 간격짧은 palindromic 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 유전자 편집을 사용하여 프로토콜을 사용하여 TF 달팽이를 예로 사용하여 세포에서 특정 유전자를 고갈. Cas9는 박테리아12에서CRISPR 서열에 보완적인 서열을 인식하고 갈라지는 이중 RNA 유도 DNA 엔도나클레스이다. CRISPR/Cas9 시스템은 현재 시험관내 및 생체 내 유전 공학을 용이하게 하기 때문에 광범위하게 활용되고있다. 단일 가이드 RNA(sgRNA)에 의해 지시된, ectopically 발현된 Cas9는 특정 유전자 궤적에서 미리 선택된 표적 시퀀스에서 이중 가닥 브레이크를 생성한다. 비동상적 종결(NHEJ)은 무작위로 뉴클레오티드 삽입 또는 삭제를 통해 Cas9 유도 가닥 나누기를 복구하여 표적 유전자의 중단 및 불활성화로 이어진다. 우리는 선택적 sgRNAs를 설계하고 설계된 sgRNA를 포함하는 렌티 바이러스 호환 벡터를 생성하기위한 세부 방법을 설명합니다. 그 결과, 안정적인 유전자 고갈된 내피 세포는 효율적이고 신뢰할 수 있는 방식으로 생성될 수 있다.
본 연구에서는, TGF-β2 유도 EndMT 공정을 검사하기 위한 모델 시스템으로 뮤린 췌장 내피 세포(MS-1)14를 사용했다. 우리의 이전 연구는 달팽이가 TGF-β2에 의해 증가된 주요 전사 인자임을 입증했으며, 이는 EndMT가 MS-1세포(15)에서유도된다. CRISPR/Cas9 유전자편집시 MS-1 세포에서 달팽이 발현을 아브로게이트하도록 편집하면 TGF-β2는 EndMT를 중재하지 못했습니다. 이 워크플로우는 다른 (의심) EndMT 관련 유전자를 연구하기 위해 적용 될 수있다.
EndMT의 메커니즘을 이해하는 것은 이 과정을 변조하고 EndMT 관련 질병을 표적으로 하는 데 중요합니다. 여기서, 우리는 TGF-β 유도된 EndMT 분석법을 수행하고 TGF-β-트리거된 EndMT에서 EndMT-TF 달팽이의 역할을 심문하는 방법을 설명했으며, 세포로부터 달팽이의 CRISPR/Cas9 매개 안정 유전자 고갈을 수행함으로써. CRISPR/Cas9 접근법을 이용한 달팽이의 고갈은 MS-1 세포에서 TGF-β2 구동EndMT(도 3C)를성공적으로 제거하였다. 어떤 사이토카인의 효과를 연구하기 위하여는, TGF-β, EndMT에, IC는 세포사동에 드러나고 그 때 EndMT의 발생은 세포에 있는 형태학적 변화 및 내피성 및 관상 마커 발현 변화에 따라 평가되었다. TGF-β2 강하게 유도 된 ENDMT MS-1 세포에 전사 인자 달팽이의 발현에 강한 증가와 함께. TGF-β 의해 유도된 EndMT-TFs종 또는 조직 별 내피 세포 유형에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 우리는 달팽이가 MS-1 세포에서 TGF-β 의해 크게 강화된 것을 관찰하고, 인간 적인 탯줄 정맥 내피 세포(HUVECs)에서는, 달팽이와 슬러그 둘 다 TGF-β20에노출된 후에 증가된다.
우리는 세포 형태 변화를 검사한 다음 EndMT 관련 마커 발현의 변화를 조사하여 두 가지 방법으로 EndMT 프로세스의 정도를 평가했습니다. 3일 동안 TGF-β 노출 후, 세포는 EndMT 관련 마커의 발현에 일관된 형태학적 변화와 함께 EndMT를 시행하였다. 여기서 수행한 면역형광 염색 외에도, 마커 변이는 단백질 발현 수준 또는 qRT-PCR(실시간 정량적 역전사 PCR)에 의해 서체 블로팅에 의해 유전자수준(21)에의해 모니터링될 수 있다. 이 프로토콜에서 보여 준 이 두 시간 및 비용 절감 방법 외에도 EndMT를 검사하는 다른 방법이 있습니다. 예를 들어, 전사 분석(RNA 염기서열 분석 또는 qPCR에 의한)을 수행하여 치료 및 대조세포 간의 내피 및 중간엽 관련 유전자의 발현 수준을 비교하여 EndMT22,23을정밀하게 평가할 수 있다. 또한, EndMT는 종종 임피던스분광기(24)에의해 평가될 수 있는 장벽 기능의 안정적인 손실을 수반한다. 더욱이, EndMT 유래 세포에 의한 줄기 세포 유사 특성의 취득에 대한 추가적인 증거를 검토할 수 있다. 예를 들어, 특정 배양 조건하에서, EndMT 중간엽과 같은 세포는 골세포, 연골세포, 선포세포 또는 (myo) 섬유아세포로 더 분화될 수 있다. 따라서, 중피계(즉, 유전자 발현 및 매트릭스 염색)에 속하는 상이한 세포 유형으로 분화되는 것을 확인하기 위한 추가 분석은 EndMT 유래 세포의 다능성 특성을 입증하는 데 유용하다. 마지막으로, EndMT 평가 방법은 시험관 내 연구에 국한되지 않고, 생체 내 또는 전 생체 기관에서 EndMT와 일부 질병 사이의 관계를 조사하기 위해 추정될 수 있다. 이러한 의미에서 내피별 계보 추적 전략의 사용은 EndMT 관련연구(25)로광범위하게 확장된다.
EndMT 도중 달팽이의 역할을 조사하기 위하여는, 이 연구 결과 CRISPR/Cas9 유전자 편집이 이 유전자를 노크하기 위하여 이용되었습니다. 데이터는 TGF-β2가 달팽이 결핍 MS-1 세포에서 EndMT를 중재하지 못했다는 것을 보여주었습니다. 이 관찰은 달팽이가 MS-1 세포에서 TGF-β2 유도 EndMT에 필수적이라는 것을 입증했다. 우리는 Snail을 대상으로 Cas9에 대한 특정 sgRNA를 소개하기 위해 독립적 인 U6 구동 sgRNA 발현 카세트를 사용했습니다. 이 방법 외에도 Ran etal.26은 SgRNA 올리고시퀀스를 Cas9 스캐폴드로 복제하여 Cas9 및 gRNAs를 모두 포함하는 구조를 생성하는 또 다른 전략을 설명했습니다. 새로운 새로운 접근 방식을 통해 CRISPR/Cas는 추가 기능을 통합할 수 있습니다. 예를 들어, 더블 또는 트리플 녹아웃은 Cas927을발현하는 세포에 더 많은 sgRNA를 전달함으로써 달성될 수 있다. 설계 된 Cas13 단백질은 내인성 DNA28을방해하지 않고 RNA 분자를 표적으로 하고 소화합니다. CRISPR/Cas로 유전자를 노크하는 것 외에도 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)는 표적 유전자발현(29)을안정적으로 노크하는 대안으로 사용될 수 있다. 모든 CRISPR/Cas 유전자 편집 방법에 대 한, 오프 타겟 분열 은 항상 고려 되어야 한다. 또한, 작은 간섭 RNA(siRNAs)는 과도 침묵 유전자 발현및 siRNA 농도가 세포분열(30)으로희석된다. 이 두 방법 모두 표적 유전자 발현을 부분적으로 억제합니다. 대조적으로, ectopic 유전자 발현은 또한 EndMT/EMT31도중 유전자 기능을 확인하기 위하여 이용됩니다. 이 접근법은 유전자의 강화 조절이 EndMT 반응을 유도하기에 충분한지 확인할 수 있습니다. 따라서 현재 EndMT의 잠재적 인 레귤레이터를 식별하고 확인하는 데 사용할 수있는 수많은 기술 전략이 있습니다. 게다가, 전사 분석은 EndMT 관련 레귤레이터의 식별 및 포괄적인 분석에 좋은 선택이 될 수 있습니다. EndMT의 변조를 조사하기 위해 다양한 보완 적 접근 법을 사용하는 것이 좋습니다.
요약하자면, TGF-β 유도된 EndMT 동안 기능적 역할을 할 수 있는 요소를 식별하는 워크플로우를 도입했습니다. 이 방법은 또한 다른 자극 (즉, 사이토카인, 성장 인자, 기계적 자극, 세포 세포 상호 작용)이 EndMT를 조절 할 수 있는지 여부를 연구하는 데 사용할 수 있으며, TGF-β 다른 자극과 상호 작용할 수 있습니다. 또한, 우리는 특정 유전자가 TGF-β 유도 EndMT에 필요한지 여부를 해명하기 위하여 CRIPSR/Cas 유전자 편집을 사용하여 접근을 강조했습니다. 이러한 방법론을 설명하기 위해, 우리는 MS-1 세포에서 강력한 EndMT 유도자 TGF-β2를 사용했지만, 프로토콜은 다른 사이토카인 및 기타 세포 유형에 적응될 수 있다. 우리는 설명된 이 상세한 프로토콜이 미래 EndMT 관련 연구를 위한 디딤돌역할을 할 것으로 기대합니다.
The authors have nothing to disclose.
연구는 CGC.NL 네덜란드 심장 혈관 연구 이니셔티브에 의해 지원되었다: 네덜란드 심장 재단, 대학 의료 센터의 네덜란드 연맹, 건강 연구 및 개발을위한 네덜란드 조직, 왕립 네덜란드 과학 아카데미 그랜트파에드라 – 영향 (http://www.phaedraresearch.nl)에 수여. JM은 중국 장학위원회의 지원을 받고 있습니다. GSD는 AFM-텔레톤 [22379], FOP 이탈리아, 라 펀다시오 라 마라토 드 TV3 (#202038)의 보조금에서 트램폴린 보조금에 의해 지원됩니다.
0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |