TGF-β-medierad endotel till mesenkymal övergång (EndMT) och funktionell bedömning av endmt-effektorer med CRISPR / Cas9 Genredigering

Summary

Vi beskriver metoder för att undersöka TGF-β2-inducerad EndMT i endotel celler genom att observera cell morfologi förändringar och undersöka uttrycket EndMT-relaterade markör förändringar med hjälp av immunofluorescens färgning. CRISPR/Cas9 genredigering beskrevs och användes för att tömma genkodningen snigel för att undersöka dess roll i TGF-β2-inducerad EndMT.

Abstract

Som svar på specifika externa signaler och aktivering av vissa transkriptionsfaktorer kan endotelceller differentiera sig till en mesenkymalliknande fenotyp, en process som kallas endotel till mesenkymal övergång (EndMT). Framväxande resultat har föreslagit att EndMT är kausally kopplat till flera mänskliga sjukdomar, såsom fibros och cancer. Dessutom kan endotel-härledda mesenchymala celler appliceras i vävnad regenerering förfaranden, eftersom de kan differentieras ytterligare i olika celltyper (t.ex. osteoblaster och kondrocyter). Således kan selektiv manipulation av EndMT ha klinisk potential. Liksom epitelial-mesenchymal övergång (EMT), EndMT kan starkt induceras av den utsöndrade cytokin omvandla tillväxtfaktor-beta (TGF-β), som stimulerar uttrycket av så kallade EndMT transkription faktorer (EndMT-TFs), inklusive snigel och snigel. Dessa EndMT-TFs sedan upp- och nedreglera nivåerna av mesenchymala respektive endotelproteiner. Här beskriver vi metoder för att undersöka TGF-β-inducerad EndMT in vitro, inklusive ett protokoll för att studera rollen av vissa TFs i TGF-β-inducerad EndMT. Med hjälp av dessa tekniker, vi ger bevis för att TGF-β2 stimulerar EndMT i murin bukspottskörteln microvascular endotelceller (MS-1 celler), och att den genetiska utarmningen av snigel med hjälp av grupperade regelbundet förhörda korta palindromiska repetitioner (CRISPR)/CRISPR-associerade protein 9 (Cas9)-medierad genredigering, abrogerar detta fenomen. Detta tillvägagångssätt kan fungera som en modell för att förhöra potentiella modulatorer av endotelbiologi, och kan användas för att utföra genetiska eller farmakologiska skärmar för att identifiera nya regulatorer av EndMT, med potentiell tillämpning vid mänsklig sjukdom.

Introduction

Endotel till mesenchymal övergång (EndMT) är ett multistep och dynamiskt biologiskt fenomen som har kopplats till olika fysiologiska och patologiska^{processer 1,2}. På EndMT endotelceller förlorar gradvis sina endotel egenskaper, samtidigt förvärva mesenchymala egenskaper^3; således, tätt komprimerade och välorganiserade endotel celler skiljer sig åt i långsträckta mesenchymala-liknande celler. Morfologiska förändringar i EndMT sammanfaller med förändringar i uttrycket av vissa gener och proteiner. I allmänhet minskar uttrycket av proteiner som upprätthåller endotelegenskaper, inklusive vaskulär endotel (VE)-cadherin, trombocyt/EG vidhäftningsmolekyl-1 (CD31/Pecam-1). Samtidigt ackumuleras proteiner relaterade till mesenkymala funktioner, såsom α-glatt muskelaktin (α-Sma) och glatt muskelprotein 22α (Sm22α). Framväxande resultat har visat att postnatal EndMT bidrar till utvecklingen av mänskliga sjukdomar, såsom cancer, hjärtfibros, pulmonell arteriell hypertoni (PAH), åderförkalkning (AS), organfibros, etc^2,4,5,6,7. En djupare förståelse för de underliggande mekanismerna i EndMT och hur man styr EndMT-processen kommer att ge nya terapeutiska metoder för EndMT-relaterade sjukdomar och regenerativ medicin.

TGF-β är en av de viktigaste EndMT-inducerarna, och andra kända involverade faktorer inkluderar Wnt / β-catenin, Notch och några inflammatoriska cytokiner¹. Eftersom cellulära sammanhang är nyckeln för svar som utlöses av TGF-β, samspelet mellan TGF-β med andra EndMT främja signaler är relevant för TGF-β att framkalla en EndMT svar. Vid aktivering av TGF-β cell yta typ I och typ II serin/treonin kinas receptorer aktiveras den intracellulära kanoniska Smad-vägen. TGF-β receptormedierade fosforylerade Smad2/3 bildar heteromeriska komplex med Smad4 som flyttar in i kärnan, där de uppreglerar uttrycket av EndMT-relaterade transkriptionsfaktorer. I likhet med epitelial-mesenchymal övergång (EMT), transkription faktorer såsom snigel, snigel, twist, zeb1 och zeb2 induceras av TGF-β signalering och bidra till gen omprogrammering i EndMT⁸.

Snigel har ofta identifierats som en nyckelfaktor i EndMT. Snigel binder till promotorn av gener som kodar cellcells vidhäftningsproteiner och undertrycker deras transkription, vilket balanseras av förbättringen av uttrycket av mesenkymala proteiner⁹. Endotelceller utgör en mycket heterogen population och den relativa påverkan av olika extracellulära stimuli på EndMT kan skilja sig mellan endotel cellulära sammanhang eller celltyper¹⁰. På grund av dess likheter med EMT är vissa metoder användbara för att undersöka båda mekanismerna EMT och EndMT⁸. I detta avseende betonar EMT International Association (TEMTIA) starkt behovet av kompletterande tekniker för att i slutändan visa förekomsten av EMT/EndMT^11.

Här beskriver vi en metod för att övervaka och visualisera TGF-β-inducerad EndMT-process. Immunofluorescensfärgning ger grundläggande information om uttrycksförändringar i riktade proteiner/markörer, som används som indikatorer på om EndMT-processen inträffar. Dessutom kan immunofluorescensfärgningen visualisera lokaliseringen av proteiner/markörer och cellmorfologi. För att studera den potentiella aktiviteten hos specifika TFs (eller andra uppströms eller nedströms regulatorer) som är involverade i TGF-β medierade EndMT, beskriver vi ett protokoll med grupperade regelbundet interspaced korta palindromic repetitioner (CRISPR) / CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) genredigering för att tömma specifika gener från celler, med TF Snail som exempel. Cas9 är en dubbel RNA-guidad DNA-endonukleas som känner igen och klyver sekvenser som kompletterar CRISPR-sekvenser i bakterier¹². CRISPR/Cas9-systemet används för närvarande i stor utsträckning eftersom det underlättar genteknik in vitro och in vivo¹³. Regisserad av en enda guide RNA (sgRNA), extopiskt uttryckt Cas9 genererar en dubbel strandbrytning vid en förvald inriktningssekvens i en specifik genlok. Icke-homolog end joining (NHEJ) äger rum för att reparera Cas9-inducerade strandbrytningar, via slumpmässiga nukleotidinfogningar eller borttagningar som därmed leder till störningar och inaktivering av den riktade genen. Vi beskriver i detalj metoder för att utforma selektiva sgRNAs och generera lentiviral-kompatibla vektorer som innehåller de utformade sgRNAs. Som ett resultat kan stabila gen-utarmade endotelceller genereras på ett effektivt och tillförlitligt sätt.

I denna studie använde vi murin bukspottskörteln microvascular endotelceller (MS-1)¹⁴ som ett modellsystem för att undersöka TGF-β2-inducerad EndMT processen. Vår tidigare studie visade att Snail är den viktigaste transkriptionsfaktorn som ökats av TGF-β2, genom vilken EndMT induceras i MS-1 celler¹⁵. På CRISPR/Cas9 genredigering för att upphäva snigel uttryck i MS-1 celler, TGF-β2 misslyckades med att medla EndMT. Detta arbetsflöde kan tillämpas för att studera andra (misstänkta) EndMT-relaterade gener.

Protocol

1. Induktion av EndMT av TGF-β2 MS-1 celler i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 100 U/mL penicillin/streptomycin i en inkubator (5% CO2,37 °C). Täck alla kulturrätter/tallrikar med 0,1% w/v gelatin i 10 min före användning. Tvätta försiktigt MS-1-celler med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt 2 ml trypsin-EDTA-lösning (0,25% trypsin och 0,02% EDTA) till en 10 cm skål och inkubera i 2 min vid 37 °C för att lossa dem. Tillsätt därefter 5 ml komplett odlingsmedium för att släcka reaktionen. Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör och centrifugera vid 200 x g i 3 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 4 ml färskt medium som innehåller FBS och penicillin/streptomycin. Räkna cellerna med hjälp av en automatisk cellräknare. Frö 1 x 103 celler per cm2 för vidare odling. Till exempel frö 9,5 x 103 celler /brunn för 6-brunnsplattor, eller 1,9 x 103 celler /brunn för 24-brunnsplattor. Inkubera cellerna över natten så att de kan klibba och återhämta sig och stimulera sedan MS-1-celler med TGF-β2 i 3 dagar. Tillsätt TGF-β receptorkinahämmare SB431542 (5 μM) 30 min före STIMULERING AV TGF-β2. Behandla andra celler med fordon (DMSO).OBS: Lös upp TGF-β2 i 4 mM HCl som innehåller 0, 1% humant bovint serumalbumin (BSA). Lägg till samma mängd ligandbuffert utan TGF-β2 i kontrollgruppen. TGF-β2-koncentrationen kan anpassas till 0,1-1 ng/ml för specifika analyser. Se indikationer i motsvarande siffror. Efter 3 dagar, undersöka cell morfologi med ljusa fältet imaging (med ett inverterat mikroskop) och utföra immunofluorescens färgning (se steg 2) för att bedöma EndMT-relaterade markör ändringar. Utför minst tre oberoende experiment för att erhålla biologiska triplicater. 2. Immunofluorescens färgning Trypsinize odlade MS-1 celler (steg 1.2) och sedan återförslutna 1,9 x 103 celler på en 0,1% w/ v gelatinbelagd 12 mm rund täckglas placerad på botten av en 24-brunnsplatta. Efter odling av cellerna över natten, tillsätt TGF-β2 (slutlig koncentration 1 ng/ml) till cellerna i 3 dagar. Använd medium innehållande ligandbuffert som negativ kontroll. Utför Pecam-1 och Sm22α färgning. Efter att ha stimulerat cellerna med TGF-β2 (eller Control) i 3 dagar, ta bort mediet och tvätta cellerna med 1x PBS. Tillsätt 300 μL 4% formaldehyd till varje brunn och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur för att fixa cellerna. Tvätta 3x med 1x PBS efter inkubation. Tillsätt 300 μL 0,1% Triton X-100 i 1x PBS till varje brunn och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur för att permeabilisera cellerna. Efter inkubation, ta bort Triton X-100-lösningen och tvätta cellerna 3x med 1x PBS. Blockera cellerna med 3% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS i 45 min vid rumstemperatur. Späd ut de primära Pecam-1- och Sm22α-antikropparna som känner igen murinproteiner 1:500 med 1x PBS. Inkubera sedan de fasta cellerna med primära antikroppar i 45 minuter vid rumstemperatur. Efter tvättning 3x med 1x PBS, inkubera cellerna med 1000x utspädda sekundära antikroppar, inklusive åsneantiråtta Alexa 488 och getantikanin Alexa 594, i 45 min vid rumstemperatur.OBS: Skydda proverna från ljus vid färgning. Efter sköljning 3x med 1x PBS, placera täckglaset såtat med celler med ansiktet nedåt på en droppe monteringsmedium som innehåller 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) på en glid för att måla kärnorna. Fixera täckglasets periferi med transparent nagellack och förvara det vid 4 °C. Skaffa representativa bilder med ett konfokalt mikroskop. Ställ in laservåglängderna på 405 nm, 488 nm respektive 552 nm för att upptäcka DAPI, Pecam-1 respektive Sm22α. För varje kanal togs alla bilder med samma inställningar och exponeringstid. Utför minst tre oberoende experiment för att erhålla biologiska triplicater. 3. Knock out of Snail med CRISPR / Cas9 redigering Designa två oberoende sgRNAs som riktar sig mot murin Snail. Designa sgRNAs med hjälp av onlineverktygen CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) och Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) enligt det riktade gennamnet och arten. Förutsäg aktiviteten utanför målet för de designade sgRNAs som riktar sig till Snail med två oberoende algoritmer, inklusive Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) och CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/). Välj två sgRNAs med den lägsta off-activity. Designa två kompletterande sgRNA oligos med BveI-skärplatsen. Sense oligo börjar med 5 ‘-ACCG-3′ och antisense oligo börjar med 5′-AAAC-3’. Beordra att oligos syntetiseras kommersiellt för vidare användning. Klona den kompletterande guiden RNA oligos till BveI-smälta AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve (bve) I-stuffer Lentiviral vektor plasmid att genereraAA19 pLKO.1-Snail-sgRNA16. Klipp AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve (bve) I-stuffer plasmid med BveI enzym16. Blanda 2 μg AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve (bve) I-stuffer plasmid, 5 μL 10x Buffer O och 5 μL BveI enzym och tillsätt sterilt vatten för att nå en total volym på 50 μL. Vortex och snurra kort ner reaktionsmixen. Inkubera reaktionen vid 37 °C i 1 timme. Ladda reaktionsblandningen på en 1% agarosgel och kör i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE, 50x TAE-bestånd: 242 g Tris-bas upplöst i vatten, 57,1 ml glacial ättiksyra, 100 ml 500 mM EDTA-lösning (pH 8,0) och tillsätt vatten till totalt 1 L) buffert tills en bra separation uppnås. Skär ryggradsfragmentet från gelén, isolera det med ett gelextraktionskit enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckningen)och eluera ryggraden i 40 μL elueringsbuffert (EB). Blanda 5 μL 100 pmol/μL sense oligo och 5 μL 100 pmol/μL antisense oligo med 1 μL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) och tillsätt sterilt vatten för att nå totalt 100 μL för att glödgning av gRNA oligos. Inkubera blandningen i 5 min vid 100 °C och täck sedan rören med aluminiumfolie. Därefter kyler du långsamt lösningen till rumstemperatur för vidare användning som insats. Att ligate den kompletterande gRNA oligos och BveI-smälta ryggraden, blanda 1 μL isolerat BveI-skär AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-stuffer ryggrad och 2 μL skär (utspädd 1:300) med 2 μL 10x T4 DNA-ligasbuffert och 1 μL T4 DNA-ligas, och tillsätt sterilt vatten för att nå totalt 20 μL. Snurra kort röret och inkubera det i 4 timmar vid rumstemperatur för vidare användning.Obs: När du utför ligaturen, se till att två kontrollgrupper ingår. För en kontrollgrupp, blanda 1 μL isolerat ryggrad, 2 μL 10x T4 DNA-ligasbuffert och 1 μL T4 DNA-ligas och tillsätt sterilt vatten för att nå totalt 20 μL, men utan oligo-DNA. För den andra kontrollgruppen, blanda 1 μL isolerat ryggrad och 2 μL 10x T4 DNA-ligasbuffert och tillsätt sterilt vatten för att nå totalt 20 μL, men utan glödgade oligos och T4 ligase. Dessa två kontroll ligationer används för att bestämma reaktions bakgrunden i nästa omvandlings steg och ange hur effektiv ligaturen är. Omvandla reaktionsblandningen till kompetent TOP10 E. coli. Samla in kompetent TOP10 E. coli. celler från frysen -80 °C och tina dem på is. Tillsätt 2 μL ligationsblandning till 50 μL kompetenta celler och håll röret på is i 30 minuter. Värmechocka röret vid 42 °C i 30 s. Lägg röret på is i 2 minuter. Tillsätt 950 μL färsk lysogent buljongmedel (LB) till blandningen och skaka kraftigt vid 37 °C i 60 min. Snurra ner och plätera cellerna på en varm ampicillin (100 μg/mL) motstånd LB-platta. Inkubera plattan vid 37 °C över natten. Kontrollera att gRNA-oligos har förs in framgångsrikt i plasmiden. Välj 3-5 kolonier på plattan i 1 ml ampicillin (100 μg/ml) som innehåller LB medium och skaka över natten vid 30 °C. Isolera plasmid-DNA:t med ett plasmidkit enligt tillverkarens protokoll (Table of Materials) och sekvensera det med U6-promotorprimerprimer 5′- GAGGGCCTATTTCCCATGATT -3′ för att verifiera den framgångsrika införandet av gRNA-oligo. 4. Generera Snigel knockout MS-1 celler Producera lentivirala partiklar som transporterar Cas9 eller Snigelinriktade gRNAs. Kultur HEK 293T celler i DMEM som innehåller 10% fetala nötkreatur serum och 100 U/mL penicillin/streptomycin i 14,5 cm rätter (eller T75 flaskor) i en inkubator (5% CO2,37 °C). Blanda 9,9 μg målgenplasmid, AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA eller pLV-Cas917 plasmid, tillsammans med hjälpplasmiderna 3,5 μg pCMV-VSVG (kodning av G-proteinet i vesikulärt stomatitvirus, VSV-G), 6,6 μg varvkänsligt element plasmid pMDLg-RRE (kodning Gag och Pol) och 5,0 μg pRSV-REV (kodning Rev) i 500 μL serumfritt medium. Återanvänd 50 μL polyetylnimin (PEI) (2,5 mg/ml) i 500 μL serumfritt medium. Blanda försiktigt plasmider och PEI-preparat genom att pipetting upp och ner. Inkubera blandningen i 20 minuter vid rumstemperatur. Transfekta HEK 293T celler genom att tillsätta blandningsmediet från steg 4,1,2 till 80% sammanflödesceller i 14,5 cm rätter (eller T75 flaskor) som innehåller DMEM medium med 10% FBS och 100 U/mL penicillin/streptomycin. HEK293T-celler används eftersom de lätt transfekteras och genererar höga nivåer av virus18. Överför transfected HEK 293T celler till en biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorium (BMBL) att odla dem i 24 h. I ett BMBL-laboratorium, ersätt transfectionmediet från HEK 293T-celler med 12 ml färsk komplett DMEM som innehåller FBS och penicillin/streptomycin. Inkubera cellerna i 24 timmar. Samla upp och filtrera mediet med en 20 ml spruta och ett filter på 0,45 μm. Överför det konditionerade mediet till ett 15 ml polypropylenrör. Tillsätt 12 ml färsk komplett DMEM som innehåller FBS och penicillin/streptomycin till HEK 293T kulturrätt och kultur i ytterligare 24 timmar. Samla upp och filtrera mediet med en 20 ml spruta och ett filter på 0,45 μm. Överför det konditionerade mediet till ett 15 ml polypropylenrör. Förvara mediet som innehåller lentivirala partiklar som 1 ml alikvoter vid -80 °C för vidare användning. Infektera MS-1 celler med pLV-Cas9 virus. Frö 1 x 105 MS-1 celler per brunn i en 6-brunnsplatta i 24 timmar före lentivirusinfektion. Tina de frysta alikvoterna av pLV-Cas9-virus i ett 37 °C vattenbad. Blanda 1 ml virusmedium med 1 ml färskt DMEM-medium som innehåller FBS och penicillin/streptomycin. Tillsätt polybren till mediet (slutlig koncentration som 10 μg/ml) för att öka infektionseffektiviteten. Ta bort mediet från 6-brunnsplattan och ersätt det med virus/ polybrenblandningsmediet och odla cellerna i en inkubator i 24 timmar.OBS: Håll alltid en oinfekterad brunn som en kontrollgrupp. Aspirera mediet från den infekterade gruppen och kontrollgruppen och ersätt det med DMEM medium med 4 μg/ml blasticidin. Sätt tillbaka plattan på en inkubator på 37 °C och odla cellerna i 1 vecka. Oinfekterade celler kommer att dö på grund av effekten av blasticidin. Dela de överlevande cellerna när de når 80% cellkonfluens och fortsätt med blasticidinval. Bekräfta uttrycket av Cas9 i MS-1 celler genom western blotting med hjälp av en antikropp mot Cas9 (molekylvikten i Cas9 är cirka 160 kDa). Infektera pLV-Cas9 MS-1 celler separat med två oberoende gRNA lentivirus. Frö 1 x 105 pLV-Cas9 MS-1 celler per brunn i en 6-brunnsplatta i 24 timmar före infektion. Följ samma protokoll som beskrivs i 4.2 för att separat infektera celler med två gRNA lentivirus. Efter 24 h infektion med gRNA-viruset, uppdatera mediet och odla cellerna i ytterligare 24 h. Ersätt mediet med DMEM med 1 μg/ml puromycin. Sätt tillbaka plattan på en inkubator på 37 °C och odla cellerna i 1 vecka. Se till att de oinfekterade cellerna är helt döda. Dela cellerna när de når 80% confluency och fortsätt puromycin markering. Bekräfta knockouten av Snail i MS-1 celler genom western blotting med en antikropp mot Snail (snigelns molekylvikt är ungefär 35 kDa).

Representative Results

TGF-β2 inducerar EndMT och stimulerar snigeluttryck i MS-1 endotelcellerTGF-β är en av cytokinerna med störst potential att inducera EndMT. Efter behandling av MS-1 celler med TGF-β2 (1 ng/mL) i 3 dagar förlorar endotel MS-1 celler sin kullerstensliknande struktur och differentierar sig till spindelformade mesenchymala celler (Figur 1A)15. För att ytterligare verifiera rollen av TGF-β2 i inducera cell fenotypiska förändringar, vi förbehandlade cellerna med den lilla molekylen aktivin receptor-liknande kinas (ALK)4/ALK5/ALK7 hämmare SB431542 före TGF-β2 stimulering19. SB431542 helt avbrutna TGF-β2-inducerad cellmorfologi förändringar (Figur 1A). Den TGF-β2 inducerade EndMT-processen undersöktes ytterligare genom att studera förändringar i uttrycket av EndMT-relaterade markörer. Som visas i figur 1Bminskade det endotelprotein pecam-1 kraftigt efter TGF-β2 stimulering, medan mesenkymal faktor Sm22α var djupt uppreglerad av TGF-β215. Dessa data överensstämmer med uppfattningen att TGF-β2 utlöste EndMT i MS-1 celler. Därefter undersökte vi effekterna av TGF-β2 på snigel och snigel uttryck. Som visas i figur 1C,Snigel var markant uppreglerad av TGF-β2, medan Slug uttryck påverkades inte av TGF-β2 i MS-1 celler15. Kvantifieringen av snigeluttryck från tre oberoende experiment visas i figur 1D. Utarmning av snigel genom CRISPR/Cas9 i MS-1 endotelceller Eftersom Snail inducerades av TGF-β2 och sannolikt deltar i TGF-β2-medierad EndMT, utförde vi CRISPR/Cas9 genredigering för att genetiskt utarma snigel uttryck i MS-1 celler. Vi antog att utarmning av snigel skulle vara tillräckligt för att hämma TGF-β2-inducerad EndMT. Som visas i figur 2A genereradevi snigel knockout celler i två steg. För det första uttrycktes Cas9 ectopically genom att infektera MS-1 celler med en Cas9 uttrycker lentivirus. Eftersom det finns en blasticidinresistenskassett i pLV-Cas9-konstruktionen kontrollerade vi uttrycket av Cas9 genom västerländsk fläckanalys i blasticidinresistenta celler (Figur 2D). Därefter introducerade vi sgRNAs som specifikt riktade snigel för att störa dess proteinuttryck. Detta förfarande utfördes också av infektion med lentivirala partiklar som bär AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA konstruktion, som innehåller en puromycin uttryck kassett. Cas9-uttrycka celler var igen infekterade med gRNA som innehåller lentivirus och vidare utvalda med puromycin. Två kompletterande sgRNA-oligos riktade mot murin snigel utformades med en förväntad låg off-target aktivitet(figur 2B,C). Efter att ha introducerat två oberoende Snail sgRNAs i Cas9 som uttrycker MS-1 celler, snigelprotein uttryck var abrogerad (Figur 2D)15. Brist på snigel hämmar TGF-β2-inducerad EndMT i MS-1-cellerFör att demonstrera funktionen av snigel i TGF-β2-medierad EndMT utförde vi en EndMT-analys i snigel-uttömda celler och jämförde den med föräldrarnas MS-1-celler. Som visas i figur 3Avar knockouten av Snail tillräcklig för att hämma den fibroblastliknande cellmorfologin driven av TGF-β2 i MS-1-celler15. Dessutom blockerades den TGF-β2-medierade nedgången i Pecam-1 och förbättringen av Sm22α helt i snigel-utarmade MS-1 celler. Sammanfattningsvis visade vi att Snail är avgörande för TGF-β2-medierad EndMT i MS-1 celler(Figur 3B)15. Figur 1. TGF-β2 inducerar EndMT och Snail uttryck i MS-1 celler. A. Effekter av TGF-β2 och/eller TGF-β typ I receptorkina inhibitor SB-431542 på cell morfologi. Brightfield bilder av MS-1 celler vid behandling med TGF-β2 (1 ng/mL) och/eller SB-431542 (SB, 5 μM, administreras 30 min före TGF-β2) i 2 dagar. Skalstången representerar 200 μm. B. Immunofluorescensfärgning av Pecam-1 (grön) och Sm22α (röd) i MS-1-celler odlade i medium som innehåller TGF-β2 (1 ng/ml) i 3 dagar. Atomkärnor visualiseras i blått (DAPI). Skalstång: 50 μm. C. Western blot med helcellslyat av TGF-β2 stimulerade MS-1 celler. Uttrycket av snigel, men inte snigel, förbättrades av TGF-β2 stimulering, som tidigare rapporterats i Ma et al15. D. Jag är inte så bra på Kvantifiering av snigeluttryck genom att integrera resultaten från tre oberoende västerländska fläckar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Figur 2. Utarmning av snigel genom CRISPR-Cas9 genredigering. A. Schema som visar hur man genererar snigel knockout celler. Bsd: Blasticidin. Puro: Puromycin. B. Jag är inte så bra på Oligonukleotider av två oberoende sgRNAs som riktar sig till Snail med CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) och Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). C. Den förväntade off-target aktiviteten av de två gRNAsna för Snail som använder Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). D. Jag är inte så bra på Cas9 och Snail uttryck i vild typ (WT) och Cas9-överuttryck MS-1 mätt med western blot analys. E. Knockout av Snail med två oberoende gRNAs i MS-1 celler mätt med western blot analys. Vi rapporterade liknande resultat i Ma et al15. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Bild 3. Genetisk utarmning av snigel hämmar TGF-β2-inducerad EndMT i MS-1 celler. A. Brightfield bilder av MS-1 celler vid behandling med TGF-β2 (0,1 ng/mL) i 3 dagar i wildtype (WT, övre panelen) och Snail slog ut (nedre panelen) celler. Skalstång representerar 200 μm. B. Immunofluorescerande färgning för Pecam-1 (grön), Sm22α (röd) och atomkärnor (blå) av MS-1 celler odlade i medium som innehåller TGF-β2 (1 ng/ml) i 3 dagar. Utarmning av snigel abrogerad TGF-β2-inducerad minskning av Pecam-1 och ökning av Sm22α uttryck. Skala bommar för föreställer 50 μm. C. Schematisk framställning av verkställa av Snail knockout på TGF-β-inducerad EndMT i MS-1 celler. TGF-β stimulerar uttrycket av Snail genom Smad väg genom fosforylering Smad2/3 och vidare driver EndMT. Slå ut Snail med CRISPR/ Cas9-baserad genredigering abrogerad TGF-β-medierad EndMT. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Att förstå mekanismen för EndMT är avgörande för att modulera denna process och rikta in sig på EndMT-relaterade sjukdomar. Här beskrev vi metoder för att utföra en TGF-β-inducerad EndMT-analys och förhöra rollen som EndMT-TF Snail i TGF-β-utlöst EndMT, genom att utföra CRISPR/ Cas9-medierad stabil genutarmning av snigel från celler. Utarmningen av snigel med CRISPR/Cas9-metoden har framgångsrikt upphävat TGF-β2-driven EndMT i MS-1-celler(figur 3C). För att studera effekterna av cytokiner, som TGF-β, på EndMT, exponerades ECs för cytokiner och sedan bedömdes förekomsten av EndMT enligt morfologiska förändringar och endotel- och mesenchymala marköruttrycksförändringar i celler. TGF-β2 starkt inducerad EndMT i MS-1 celler åtföljd av en stark ökning av uttrycket av transkription faktorn snigel. EndMT-TFs framkallas av TGF-β kan skilja sig åt beroende på arten eller vävnadsspecifika endotel celltyp. Till exempel observerade vi att Snail men inte Slug var signifikant uppreglerad av TGF-β i MS-1 celler, medan i mänskliga navelceller (HUVECs), både snigel och snigel ökas efter exponering för TGF-β²⁰.

Vi bedömde omfattningen av EndMT-processen på två sätt genom att undersöka cellmorfologiförändringar och sedan genom att undersöka förändringar i EndMT-relaterade markörer uttryck. Efter TGF-β exponering i 3 dagar genomgick cellerna EndMT med konsekvent morfologiska variationer och förändringar i uttrycket av EndMT-relaterade markörer. Förutom immunofluorescensfärgningen vi utförde här, kan markörvariationer också övervakas genom western blotting på proteinuttrycksnivå eller av qRT-PCR (Realtid Quantitative Reverse Transcription PCR) på gennivåerna²¹. Utöver dessa två tids- och kostnadsbesparande metoder som vi visade i detta protokoll finns det andra metoder för att undersöka EndMT. Till exempel kan transkriptions- och mesenkymalrelaterade gener mellan behandlade och kontrollceller exakt bedöma EndMT^22,23. Dessutom innebär EndMT ofta stabil förlust av barriärfunktion, vilket kan bedömas med impedansspektroskopi²⁴. Dessutom kan ytterligare bevis på att EndMT-härledda celler har inlämnat stamcellsliknande egenskaper undersökas. Till exempel, under specifika odlingsförhållanden, EndMT mesenchymal-liknande celler kan ytterligare differentieras till osteoblaster, kondrocyter, adipocyter eller (myo)fibroblaster. Därför är ytterligare analys för att bekräfta differentiering i olika celltyper som tillhör mesoderm härstamningen (dvs. genuttryck och matrisfärgning) användbar för att visa den multipotenta karaktären hos EndMT-härledda celler. Slutligen är EndMT-bedömningsmetoderna inte begränsade till in vitro-studier, men kan extrapoleras för att undersöka sambandet mellan EndMT och vissa sjukdomar in vivo eller i ex vivo-organ. I den meningen utvidgas användningen av endotelspecifika härstamningsstrategier i stort sett till EndMT-relaterad forskning²⁵.

För att undersöka rollen som Snail under EndMT användes i denna studie CRISPR/ Cas9 genredigering för att slå ut denna gen. Uppgifterna visade att TGF-β2 misslyckades med att medla EndMT i Snigelbrist MS-1 celler. Denna iakttagelse visade att snigel är avgörande för TGF-β2 inducerad EndMT i MS-1 celler. Vi använde en oberoende U6-driven sgRNA uttryck kassett för att införa specifika sgRNAs för Cas9 att rikta snigel. Utöver denna metod beskrev Ran et al.^{26 en} annan strategi för kloning av sgRNA-oligossekvensen i Cas9-ställningen för att generera en konstruktion som innehåller både Cas9 och gRNAs. Nya nya tillvägagångssätt gör det möjligt för CRISPR/Cas att införliva ytterligare funktioner. Till exempel kan dubbla eller tredubbla knockouts uppnås genom att leverera fler sgRNAs till celler som uttrycker Cas9²⁷. Det konstruerade Cas13-proteinet riktar in sig på och smälter RNA-molekyler utan att störa endogent DNA²⁸. Förutom att slå ut gener med CRISPR/Cas kan korta hårnåls-RNAs (shRNAs) användas som alternativ för att stabilt slå ner riktade genuttryck²⁹. För alla CRISPR/Cas-genredigeringsmetoder bör klyvning utanför målet alltid beaktas. Dessutom tystar små störande RNAs (siRNAs) övergående genuttryck och siRNA-koncentrationen späds ut med celldelning³⁰. Båda dessa metoder undertrycker delvis riktade genuttryck. Däremot används utomkvedshavandeskap också för att verifiera genfunktionen under EndMT/EMT³¹. Detta tillvägagångssätt kan avgöra om uppregleringen av en gen är tillräcklig för att framkalla ett EndMT-svar. Därför finns det för närvarande en mängd tekniska strategier som kan användas för att identifiera och verifiera potentiella tillsynsmyndigheter för EndMT. Dessutom kan transkriptionsanalys vara ett bra alternativ i identifiering och omfattande analys av EndMT-relaterade tillsynsmyndigheter. Vi rekommenderar att du använder olika kompletterande metoder för att undersöka modulering av EndMT.

Sammanfattningsvis introducerade vi ett arbetsflöde för att identifiera faktorer som kan spela funktionella roller under TGF-β-inducerad EndMT. Denna metod kan också användas för att studera om andra stimuli (dvs cytokiner, tillväxtfaktorer, mekaniska stimuli, cellcellsinteraktioner) kan modulera EndMT och samspelet mellan TGF-β med andra stimuli. Dessutom lyfte vi fram ett tillvägagångssätt med CRIPSR/Cas genredigering för att klargöra om en viss gen krävs för TGF-β-inducerad EndMT. För att illustrera denna metod använde vi den starka EndMT-induceraren TGF-β2 i MS-1-celler, men protokollen kan anpassas till andra cytokiner och andra celltyper. Vi förväntar oss att detta detaljerade protokoll som beskrivs kommer att fungera som en språngbräda för framtida EndMT-relaterade studier.

Materials

0.45 μm filter	Pall Corporation, USA	4614
10× T4 DNA ligase buffer	Thermofisher Scientific, USA	B69
12 mm round glass slice	Knittel Glass,Germany	VD10012Y1A.01
20 mL syringe	BD Eclipse, USA	300629
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories, USA	H-1200	VECTASHIELD Antifade Mounting Media
AA19_PLKO vector	Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands		Gift
Ampicillin	Serva Electrophoresis, USA	1339903
Anti-Mouse IgG	GE Healthcare, USA	NA931
Anti-Rabbit IgG	Cell signaling, USA	7074
Agarose	Roche, Switzerland	11388991001
Blasticidin	Invitrogen, USA	R21001
Buffer O (10X)	Thermofisher Scientific, USA	BO5
BveI (Bspm1)	Thermofisher Scientific, USA	ER 1741
Confocal microscope	Leica Microsystems, Germany	SP8
DMEM	Thermo Fisher Scientific, USA	11965092
Donkey anti-rat Alexa 488	Invitrogen, USA	A21208
FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	16000044
Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific, USA	28908
Inverted microscope	Leica Microsystems, Germany	DMi8
Goat anti-rabbit Alexa 594	Invitrogen,USA	A11012
LabNed Plasmid kit	LabNed, USA	LN2400004
MS-1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC)
Nail polish	HEMA, Netherlands		Transparent
Pecam-1 antibody	Becton Dickinson,USA	553370
PEI	Polysciences, USA	23966-1
PLV-Cas9 plasmid	Sigma-Aldrich, USA	Cas9BST-1EA
Puromycin	Sigma-Aldrich, USA	P9620
QIAquick gel extraction kit	Qiagen, Germany	28706
Sm22a antibody	Abcam, UK	ab14106
Snail	Cell signaling, USA	3879
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific, USA	EL 0014
TC20 automated Cell Counter	Bio-Rad, USA	1450102
Human TGF-β2	Joachim Nickel, University of Wurzburg	Gift	Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems
Triton X-100	Merck, USA	1086031000
SB431542	Tocris Bioscience, UK	1614
Tris	Roche, Switzerland	11814273001