Vi beskriver metoder för att undersöka TGF-β2-inducerad EndMT i endotel celler genom att observera cell morfologi förändringar och undersöka uttrycket EndMT-relaterade markör förändringar med hjälp av immunofluorescens färgning. CRISPR/Cas9 genredigering beskrevs och användes för att tömma genkodningen snigel för att undersöka dess roll i TGF-β2-inducerad EndMT.
Som svar på specifika externa signaler och aktivering av vissa transkriptionsfaktorer kan endotelceller differentiera sig till en mesenkymalliknande fenotyp, en process som kallas endotel till mesenkymal övergång (EndMT). Framväxande resultat har föreslagit att EndMT är kausally kopplat till flera mänskliga sjukdomar, såsom fibros och cancer. Dessutom kan endotel-härledda mesenchymala celler appliceras i vävnad regenerering förfaranden, eftersom de kan differentieras ytterligare i olika celltyper (t.ex. osteoblaster och kondrocyter). Således kan selektiv manipulation av EndMT ha klinisk potential. Liksom epitelial-mesenchymal övergång (EMT), EndMT kan starkt induceras av den utsöndrade cytokin omvandla tillväxtfaktor-beta (TGF-β), som stimulerar uttrycket av så kallade EndMT transkription faktorer (EndMT-TFs), inklusive snigel och snigel. Dessa EndMT-TFs sedan upp- och nedreglera nivåerna av mesenchymala respektive endotelproteiner. Här beskriver vi metoder för att undersöka TGF-β-inducerad EndMT in vitro, inklusive ett protokoll för att studera rollen av vissa TFs i TGF-β-inducerad EndMT. Med hjälp av dessa tekniker, vi ger bevis för att TGF-β2 stimulerar EndMT i murin bukspottskörteln microvascular endotelceller (MS-1 celler), och att den genetiska utarmningen av snigel med hjälp av grupperade regelbundet förhörda korta palindromiska repetitioner (CRISPR)/CRISPR-associerade protein 9 (Cas9)-medierad genredigering, abrogerar detta fenomen. Detta tillvägagångssätt kan fungera som en modell för att förhöra potentiella modulatorer av endotelbiologi, och kan användas för att utföra genetiska eller farmakologiska skärmar för att identifiera nya regulatorer av EndMT, med potentiell tillämpning vid mänsklig sjukdom.
Endotel till mesenchymal övergång (EndMT) är ett multistep och dynamiskt biologiskt fenomen som har kopplats till olika fysiologiska och patologiskaprocesser 1,2. På EndMT endotelceller förlorar gradvis sina endotel egenskaper, samtidigt förvärva mesenchymala egenskaper3; således, tätt komprimerade och välorganiserade endotel celler skiljer sig åt i långsträckta mesenchymala-liknande celler. Morfologiska förändringar i EndMT sammanfaller med förändringar i uttrycket av vissa gener och proteiner. I allmänhet minskar uttrycket av proteiner som upprätthåller endotelegenskaper, inklusive vaskulär endotel (VE)-cadherin, trombocyt/EG vidhäftningsmolekyl-1 (CD31/Pecam-1). Samtidigt ackumuleras proteiner relaterade till mesenkymala funktioner, såsom α-glatt muskelaktin (α-Sma) och glatt muskelprotein 22α (Sm22α). Framväxande resultat har visat att postnatal EndMT bidrar till utvecklingen av mänskliga sjukdomar, såsom cancer, hjärtfibros, pulmonell arteriell hypertoni (PAH), åderförkalkning (AS), organfibros, etc2,4,5,6,7. En djupare förståelse för de underliggande mekanismerna i EndMT och hur man styr EndMT-processen kommer att ge nya terapeutiska metoder för EndMT-relaterade sjukdomar och regenerativ medicin.
TGF-β är en av de viktigaste EndMT-inducerarna, och andra kända involverade faktorer inkluderar Wnt / β-catenin, Notch och några inflammatoriska cytokiner1. Eftersom cellulära sammanhang är nyckeln för svar som utlöses av TGF-β, samspelet mellan TGF-β med andra EndMT främja signaler är relevant för TGF-β att framkalla en EndMT svar. Vid aktivering av TGF-β cell yta typ I och typ II serin/treonin kinas receptorer aktiveras den intracellulära kanoniska Smad-vägen. TGF-β receptormedierade fosforylerade Smad2/3 bildar heteromeriska komplex med Smad4 som flyttar in i kärnan, där de uppreglerar uttrycket av EndMT-relaterade transkriptionsfaktorer. I likhet med epitelial-mesenchymal övergång (EMT), transkription faktorer såsom snigel, snigel, twist, zeb1 och zeb2 induceras av TGF-β signalering och bidra till gen omprogrammering i EndMT8.
Snigel har ofta identifierats som en nyckelfaktor i EndMT. Snigel binder till promotorn av gener som kodar cellcells vidhäftningsproteiner och undertrycker deras transkription, vilket balanseras av förbättringen av uttrycket av mesenkymala proteiner9. Endotelceller utgör en mycket heterogen population och den relativa påverkan av olika extracellulära stimuli på EndMT kan skilja sig mellan endotel cellulära sammanhang eller celltyper10. På grund av dess likheter med EMT är vissa metoder användbara för att undersöka båda mekanismerna EMT och EndMT8. I detta avseende betonar EMT International Association (TEMTIA) starkt behovet av kompletterande tekniker för att i slutändan visa förekomsten av EMT/EndMT11.
Här beskriver vi en metod för att övervaka och visualisera TGF-β-inducerad EndMT-process. Immunofluorescensfärgning ger grundläggande information om uttrycksförändringar i riktade proteiner/markörer, som används som indikatorer på om EndMT-processen inträffar. Dessutom kan immunofluorescensfärgningen visualisera lokaliseringen av proteiner/markörer och cellmorfologi. För att studera den potentiella aktiviteten hos specifika TFs (eller andra uppströms eller nedströms regulatorer) som är involverade i TGF-β medierade EndMT, beskriver vi ett protokoll med grupperade regelbundet interspaced korta palindromic repetitioner (CRISPR) / CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) genredigering för att tömma specifika gener från celler, med TF Snail som exempel. Cas9 är en dubbel RNA-guidad DNA-endonukleas som känner igen och klyver sekvenser som kompletterar CRISPR-sekvenser i bakterier12. CRISPR/Cas9-systemet används för närvarande i stor utsträckning eftersom det underlättar genteknik in vitro och in vivo13. Regisserad av en enda guide RNA (sgRNA), extopiskt uttryckt Cas9 genererar en dubbel strandbrytning vid en förvald inriktningssekvens i en specifik genlok. Icke-homolog end joining (NHEJ) äger rum för att reparera Cas9-inducerade strandbrytningar, via slumpmässiga nukleotidinfogningar eller borttagningar som därmed leder till störningar och inaktivering av den riktade genen. Vi beskriver i detalj metoder för att utforma selektiva sgRNAs och generera lentiviral-kompatibla vektorer som innehåller de utformade sgRNAs. Som ett resultat kan stabila gen-utarmade endotelceller genereras på ett effektivt och tillförlitligt sätt.
I denna studie använde vi murin bukspottskörteln microvascular endotelceller (MS-1)14 som ett modellsystem för att undersöka TGF-β2-inducerad EndMT processen. Vår tidigare studie visade att Snail är den viktigaste transkriptionsfaktorn som ökats av TGF-β2, genom vilken EndMT induceras i MS-1 celler15. På CRISPR/Cas9 genredigering för att upphäva snigel uttryck i MS-1 celler, TGF-β2 misslyckades med att medla EndMT. Detta arbetsflöde kan tillämpas för att studera andra (misstänkta) EndMT-relaterade gener.
Att förstå mekanismen för EndMT är avgörande för att modulera denna process och rikta in sig på EndMT-relaterade sjukdomar. Här beskrev vi metoder för att utföra en TGF-β-inducerad EndMT-analys och förhöra rollen som EndMT-TF Snail i TGF-β-utlöst EndMT, genom att utföra CRISPR/ Cas9-medierad stabil genutarmning av snigel från celler. Utarmningen av snigel med CRISPR/Cas9-metoden har framgångsrikt upphävat TGF-β2-driven EndMT i MS-1-celler(figur 3C). För att studera effekterna av cytokiner, som TGF-β, på EndMT, exponerades ECs för cytokiner och sedan bedömdes förekomsten av EndMT enligt morfologiska förändringar och endotel- och mesenchymala marköruttrycksförändringar i celler. TGF-β2 starkt inducerad EndMT i MS-1 celler åtföljd av en stark ökning av uttrycket av transkription faktorn snigel. EndMT-TFs framkallas av TGF-β kan skilja sig åt beroende på arten eller vävnadsspecifika endotel celltyp. Till exempel observerade vi att Snail men inte Slug var signifikant uppreglerad av TGF-β i MS-1 celler, medan i mänskliga navelceller (HUVECs), både snigel och snigel ökas efter exponering för TGF-β20.
Vi bedömde omfattningen av EndMT-processen på två sätt genom att undersöka cellmorfologiförändringar och sedan genom att undersöka förändringar i EndMT-relaterade markörer uttryck. Efter TGF-β exponering i 3 dagar genomgick cellerna EndMT med konsekvent morfologiska variationer och förändringar i uttrycket av EndMT-relaterade markörer. Förutom immunofluorescensfärgningen vi utförde här, kan markörvariationer också övervakas genom western blotting på proteinuttrycksnivå eller av qRT-PCR (Realtid Quantitative Reverse Transcription PCR) på gennivåerna21. Utöver dessa två tids- och kostnadsbesparande metoder som vi visade i detta protokoll finns det andra metoder för att undersöka EndMT. Till exempel kan transkriptions- och mesenkymalrelaterade gener mellan behandlade och kontrollceller exakt bedöma EndMT22,23. Dessutom innebär EndMT ofta stabil förlust av barriärfunktion, vilket kan bedömas med impedansspektroskopi24. Dessutom kan ytterligare bevis på att EndMT-härledda celler har inlämnat stamcellsliknande egenskaper undersökas. Till exempel, under specifika odlingsförhållanden, EndMT mesenchymal-liknande celler kan ytterligare differentieras till osteoblaster, kondrocyter, adipocyter eller (myo)fibroblaster. Därför är ytterligare analys för att bekräfta differentiering i olika celltyper som tillhör mesoderm härstamningen (dvs. genuttryck och matrisfärgning) användbar för att visa den multipotenta karaktären hos EndMT-härledda celler. Slutligen är EndMT-bedömningsmetoderna inte begränsade till in vitro-studier, men kan extrapoleras för att undersöka sambandet mellan EndMT och vissa sjukdomar in vivo eller i ex vivo-organ. I den meningen utvidgas användningen av endotelspecifika härstamningsstrategier i stort sett till EndMT-relaterad forskning25.
För att undersöka rollen som Snail under EndMT användes i denna studie CRISPR/ Cas9 genredigering för att slå ut denna gen. Uppgifterna visade att TGF-β2 misslyckades med att medla EndMT i Snigelbrist MS-1 celler. Denna iakttagelse visade att snigel är avgörande för TGF-β2 inducerad EndMT i MS-1 celler. Vi använde en oberoende U6-driven sgRNA uttryck kassett för att införa specifika sgRNAs för Cas9 att rikta snigel. Utöver denna metod beskrev Ran et al.26 en annan strategi för kloning av sgRNA-oligossekvensen i Cas9-ställningen för att generera en konstruktion som innehåller både Cas9 och gRNAs. Nya nya tillvägagångssätt gör det möjligt för CRISPR/Cas att införliva ytterligare funktioner. Till exempel kan dubbla eller tredubbla knockouts uppnås genom att leverera fler sgRNAs till celler som uttrycker Cas927. Det konstruerade Cas13-proteinet riktar in sig på och smälter RNA-molekyler utan att störa endogent DNA28. Förutom att slå ut gener med CRISPR/Cas kan korta hårnåls-RNAs (shRNAs) användas som alternativ för att stabilt slå ner riktade genuttryck29. För alla CRISPR/Cas-genredigeringsmetoder bör klyvning utanför målet alltid beaktas. Dessutom tystar små störande RNAs (siRNAs) övergående genuttryck och siRNA-koncentrationen späds ut med celldelning30. Båda dessa metoder undertrycker delvis riktade genuttryck. Däremot används utomkvedshavandeskap också för att verifiera genfunktionen under EndMT/EMT31. Detta tillvägagångssätt kan avgöra om uppregleringen av en gen är tillräcklig för att framkalla ett EndMT-svar. Därför finns det för närvarande en mängd tekniska strategier som kan användas för att identifiera och verifiera potentiella tillsynsmyndigheter för EndMT. Dessutom kan transkriptionsanalys vara ett bra alternativ i identifiering och omfattande analys av EndMT-relaterade tillsynsmyndigheter. Vi rekommenderar att du använder olika kompletterande metoder för att undersöka modulering av EndMT.
Sammanfattningsvis introducerade vi ett arbetsflöde för att identifiera faktorer som kan spela funktionella roller under TGF-β-inducerad EndMT. Denna metod kan också användas för att studera om andra stimuli (dvs cytokiner, tillväxtfaktorer, mekaniska stimuli, cellcellsinteraktioner) kan modulera EndMT och samspelet mellan TGF-β med andra stimuli. Dessutom lyfte vi fram ett tillvägagångssätt med CRIPSR/Cas genredigering för att klargöra om en viss gen krävs för TGF-β-inducerad EndMT. För att illustrera denna metod använde vi den starka EndMT-induceraren TGF-β2 i MS-1-celler, men protokollen kan anpassas till andra cytokiner och andra celltyper. Vi förväntar oss att detta detaljerade protokoll som beskrivs kommer att fungera som en språngbräda för framtida EndMT-relaterade studier.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen stöddes av CGC.NL och Nederländerna Cardio Vascular Research Initiative: Dutch Heart Foundation, Dutch Federation of University Medical Centers, Nederländerna Organization for Health Research and Development och Royal Netherlands Academy of Sciences Grant som tilldelades Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM stöds av Kinas stipendieråd. GSD stöds av ett trampolinbidrag från AFM-Telethon [22379], FOP Italia och ett bidrag från La Fundació La Marató de TV3 (#202038).
0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |