Nous décrivons des méthodes pour étudier l’EndMT induite par le TGF-β2 dans les cellules endothéliales en observant les changements de morphologie cellulaire et en examinant les changements de marqueur liés à l’endMT d’expression à l’aide de la coloration par immunofluorescence. L’édition du gène CRISPR/Cas9 a été décrite et utilisée pour épuiser le gène codant pour l’escargot afin d’étudier son rôle dans l’EndMT induite par le TGF-β2.
En réponse à des indices externes spécifiques et à l’activation de certains facteurs de transcription, les cellules endothéliales peuvent se différencier en un phénotype de type mésenchymateux, un processus appelé transition endothéliale à mésenchymateuse (EndMT). De nouveaux résultats suggèrent que l’EndMT est causalement liée à de multiples maladies humaines, telles que la fibrose et le cancer. En outre, les cellules mésenchymateuses endothéliales dérivées peuvent être appliquées dans les procédures de régénération tissulaire, car elles peuvent être différenciées en divers types de cellules (par exemple, ostéoblastes et chondrocytes). Ainsi, la manipulation sélective d’EndMT peut avoir le potentiel clinique. Comme la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), EndMT peut être fortement induite par la cytokine sécrétée transformant le facteur de croissance bêta (TGF-β), qui stimule l’expression des facteurs de transcription endMT (EndMT-TFs), y compris l’escargot et la limace. Ces EndMT-TFs régulent ensuite à la hausse et à la baisse les niveaux de protéines mésenchymateuses et endothéliales, respectivement. Ici, nous décrivons des méthodes pour étudier l’EndMT induite par TGF-β in vitro, y compris un protocole pour étudier le rôle de TFs particuliers dans l’EndMT causé par TGF-β. À l’aide de ces techniques, nous fournissons des preuves que le TGF-β2 stimule l’EndMT dans les cellules endothéliales microvasculaires pancréatiques murines (cellules MS-1), et que l’épuisement génétique de l’escargot à l’aide de courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées (CRISPR) / crispr-associated protein 9 (Cas9) -médiée par l’édition de gènes, abroge ce phénomène. Cette approche peut servir de modèle pour interroger les modulateurs potentiels de la biologie endothéliale, et peut être utilisée pour effectuer des tests génétiques ou pharmacologiques afin d’identifier de nouveaux régulateurs de l’EndMT, avec une application potentielle dans les maladies humaines.
La transition endothéliale à mésenchymateuse (EndMT) est un phénomène biologique dynamique et en plusieurs étapes qui a été lié à divers processus physiologiques et pathologiques1,2. A l’EndMT les cellules endothéliales perdent progressivement leurs traits endothéliaux, tout en acquérant des propriétés mésenchymateuses3; ainsi, les cellules endothéliales étroitement compactées et bien organisées se différencient en cellules allongées de type mésenchymatel. Les changements morphologiques dans EndMT coïncident avec des altérations dans l’expression de certains gènes et protéines. En général, l’expression des protéines qui maintiennent des caractéristiques endothéliales, y compris endothéliale vasculaire (VE) – cadhérine, plaquette/EC adhérence molecule-1 (CD31/Pecam-1) diminue. Simultanément, les protéines liées aux fonctions mésenchymateuses, telles que l’actine du muscle α lisse (α-Sma) et la protéine du muscle lisse 22α (Sm22α) s’accumulent. Les résultats émergents ont démontré que l’EndMT postnatal contribue au développement de maladies humaines, telles que le cancer, la fibrose cardiaque, l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), l’athérosclérose (SA), la fibrose d’organe,etc. 2,4,5,6,7. Une compréhension plus approfondie des mécanismes sous-jacents de l’EndMT et de la façon de diriger le processus endMT fournira de nouvelles méthodes thérapeutiques pour les maladies liées à l’EndMT et la médecine régénérative.
TGF-β est l’un des principaux inducteurs d’EndMT, et d’autres facteurs impliqués connus incluent Wnt/β-caténoïne, Notch, et quelques cytokines inflammatoires1. Étant donné que le contexte cellulaire est essentiel pour les réponses déclenchées par TGF-β, l’interaction de TGF-β avec d’autres signaux de promotion EndMT est pertinente pour que TGF-β pour obtenir une réponse EndMT. Lors de l’activation du type I de surface cellulaire TGF-β et des récepteurs kinases de sérine/thréonine de type II, la voie canonique intracellulaire de Smad est activée. Les Smad2/3 phosphorylé médiés par les récepteurs TGF-β forment des complexes hétéromériques avec Smad4 qui se translocalisent dans le noyau, où ils régulent à la hausse l’expression des facteurs de transcription liés à EndMT. Similaires à la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), les facteurs de transcription tels que Snail, Slug, Twist, Zeb1 et Zeb2 sont induits par la signalisation TGF-β et contribuent à la reprogrammation des gènes dans EndMT8.
L’escargot a souvent été identifié comme un facteur clé dans EndMT. L’escargot se lie au promoteur des gènes codant pour les protéines d’adhésion cellule-cellule et supprime leur transcription, qui est contrebalancée par l’amélioration de l’expression des protéines mésenchymateuses9. Les cellules endothéliales comprennent une population très hétérogène et l’influence relative de divers stimuli extracellulaires sur EndMT peut différer parmi les contextes cellulaires endothéliaux ou les types de cellules10. En raison de ses similitudes avec EMT, certaines méthodologies sont utiles pour étudier à la fois les mécanismes EMT et EndMT8. À cet égard, l’Association internationale EMT (TEMTIA) souligne fortement la nécessité de techniques complémentaires pour démontrer à terme l’occurrence de l’EMT/EndMT11.
Nous décrivons ici une méthode pour surveiller et visualiser le processus EndMT induit par TGF-β. La coloration par immunofluorescence fournit les informations de base sur les changements d’expression dans les protéines / marqueurs ciblés, qui sont utilisés comme indicateurs de la survie du processus EndMT. De plus, la coloration par immunofluorescence peut visualiser la localisation des protéines/marqueurs et la morphologie cellulaire. Pour étudier l’activité potentielle de TFs spécifiques (ou d’autres régulateurs en amont ou en aval) impliqués dans l’EndMT médiée par TGF-β, nous décrivons un protocole utilisant des répétitions palindromiques courtes régulièrement interespaced groupées (CRISPR) / CRISPR-associated protein 9 (Cas9) édition du gène pour épuiser des gènes spécifiques des cellules, en utilisant l’escargot TF comme exemple. Cas9 est une endonucléase d’ADN guidée par double ARN qui reconnaît et fend des séquences complémentaires aux séquences CRISPR chez les bactéries12. Le système CRISPR/Cas9 est actuellement largement utilisé car il facilite le génie génétique in vitro et in vivo13. Dirigé par un ARN guide unique (SGRNA), Cas9 exprimé ectopiquement génère une rupture double brin à une séquence de ciblage présélectionnée dans un locus de gène spécifique. L’assemblage d’extrémité non homologue (NHEJ) a lieu pour réparer les ruptures de brin induites par Cas9, via des insertions ou des délétions de nucléotides aléatoires conduisant ainsi à la perturbation et à l’inactivation du gène ciblé. Nous décrivons en détail des méthodes pour concevoir des sgRNAs sélectifs et générer des vecteurs lentiviral-compatibles contenant les sgRNAs conçus. En conséquence, des cellules endothéliales stables appauvries en gènes peuvent être générées d’une manière efficace et fiable.
Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules endothéliales microvasculaires pancréatiques murines (MS-1)14 comme système modèle pour examiner le processus EndMT induit par le TGF-β2. Notre étude précédente a démontré que l’escargot est le principal facteur de transcription augmenté par TGF-β2, par lequel EndMT est induit dans les cellulesMS-1 15. Lors de l’édition du gène CRISPR/Cas9 pour abroger l’expression de l’escargot dans les cellules MS-1, TGF-β2 n’a pas réussi à arbitrer EndMT. Ce flux de travail peut être appliqué pour étudier d’autres gènes (suspects) liés à l’EndMT.
Comprendre le mécanisme d’EndMT est essentiel pour moduler ce processus et cibler les maladies liées à EndMT. Ici, nous avons décrit des méthodes pour exécuter un essai EndMT induit par TGF-β et interroger le rôle de l’escargot EndMT-TF dans l’endMT déclenché par TGF-β, en exécutant l’épuisement stable de gène CRISPR/Cas9-négocié de l’escargot des cellules. L’épuisement de l’escargot à l’aide de l’approche CRISPR/Cas9 a réussi à abroger L’EndMT entraîné par TGF-β2 dans les cellules MS-1(figure 3C). Pour étudier les effets de toutes les cytokines, comme TGF-β, sur EndMT, des ECs ont été exposés aux cytokines et puis l’occurrence d’EndMT a été évaluée selon les changements morphologiques et les changements endothéliaux et mesenchymal d’expression de marqueur des cellules. TGF-β2 fortement induit EndMT dans les cellules MS-1 accompagné d’une forte augmentation de l’expression du facteur de transcription Escargot. Les EndMT-TFs induits par TGF-β peuvent différer selon l’espèce ou le type de cellule endothéliale tissu-spécifique. Par exemple, nous avons observé que l’escargot mais pas la limace était significativement régulé à la hausse par le TGF-β dans les cellules MS-1, tandis que dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs), l’escargot et la limace sont augmentés après une exposition au TGF-β20.
Nous avons évalué l’étendue du processus EndMT de deux manières en examinant les changements de morphologie cellulaire, puis en étudiant les changements dans l’expression des marqueurs liés à EndMT. Après exposition de TGF-β pendant 3 jours, les cellules ont subi EndMT avec des variations morphologiques cohérentes et des changements dans l’expression des marqueurs EndMT-connexes. En plus de la coloration par immunofluorescence que nous avons effectuée ici, les variations de marqueurs peuvent également être surveillées par western blotting au niveau de l’expression protéique ou par qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR) aux niveaux des gènes21. En plus de ces deux méthodes d’économie de temps et de coûts que nous avons montrées dans ce protocole, il existe d’autres méthodes pour examiner EndMT. Par exemple, effectuer une analyse du transcriptome (par séquençage de l’ARN ou qPCR) pour comparer les niveaux d’expression des gènes endothéliaux et mésenchymates entre les cellules traitées et les cellules témoins peut évaluer avec précision EndMT22,23. En outre, EndMT implique souvent la perte stable de la fonction barrière, qui peut être évaluée par spectroscopie d’impédance24. En outre, des preuves supplémentaires de l’acquisition de propriétés de type cellules souches par les cellules dérivées d’EndMT peuvent être examinées. Par exemple, dans des conditions de culture spécifiques, les cellules de type mésenchymateux EndMT peuvent être différenciées en ostéoblastes, chondrocytes, adipocytes ou (myo)fibroblastes. Par conséquent, une analyse supplémentaire pour confirmer la différenciation en différents types de cellules appartenant à la lignée mésodermique (c.-à-d. expression génique et coloration de la matrice) est utile pour démontrer la nature multipotente des cellules dérivées de l’EndMT. Enfin, les méthodes d’évaluation EndMT ne se limitent pas aux études in vitro, mais peuvent être extrapolées pour étudier la relation entre EndMT et certaines maladies in vivo ou dans des organes ex vivo. En ce sens, l’utilisation de stratégies de traçage de lignées spécifiques à l’endothélial est largement étendue à la recherche liée à l’EndMT25.
Pour étudier le rôle de l’escargot pendant EndMT, dans cette étude, l’édition du gène CRISPR/Cas9 a été utilisée pour éliminer ce gène. Les données ont montré que le TGF-β2 n’a pas réussi à arbitrer EndMT dans les cellules MS-1 déficientes en escargot. Cette observation a démontré que l’escargot est essentiel pour l’EndMT induite par le TGF-β2 dans les cellules MS-1. Nous avons utilisé une cassette d’expression sgRNA indépendante pilotée par U6 pour introduire des sgARN spécifiques pour Cas9 afin de cibler Snail. En plus de cette méthode, Ran et al.26 ont décrit une autre stratégie pour cloner la séquence d’oligos sgRNA dans l’échafaudage Cas9 pour générer une construction contenant à la fois Cas9 et gARN. Les nouvelles approches émergentes permettent à CRISPR/Cas d’intégrer des fonctions supplémentaires. Par exemple, des knockouts doubles ou triples peuvent être obtenus en délivrant plus de sgRNAs dans les cellules exprimant Cas927. La protéine Cas13 modifiée cible et digère les molécules d’ARN sans perturber l’ADN endogène28. En plus d’assommer les gènes avec CRISPR/Cas, les ARN en épingle à cheveux courts (shARN) peuvent être utilisés comme alternatives pour faire tomber de manière stable l’expression des gènes ciblés29. Pour toutes les méthodes d’édition de gènes CRISPR/Cas, le clivage hors cible doit toujours être pris en considération. De plus, les petits ARN interférents (ARNi) réduisent transitoirement l’expression des gènes et la concentration d’ARNsi est diluée avec la division cellulaire30. Ces deux méthodes suppriment partiellement l’expression des gènes ciblés. En revanche, l’expression des gènes ectopiques est également utilisée pour vérifier la fonction des gènes au cours de l’EndMT/EMT31. Cette approche peut déterminer si la régulation à la hausse d’un gène est suffisante pour obtenir une réponse EndMT. Par conséquent, il existe actuellement une multitude de stratégies techniques qui peuvent être utilisées pour identifier et vérifier les régulateurs potentiels d’EndMT. En outre, l’analyse transcriptomique peut être une bonne option dans l’identification et l’analyse complète des régulateurs liés à EndMT. Nous vous recommandons d’utiliser différentes approches complémentaires pour étudier la modulation d’EndMT.
En résumé, nous avons introduit un flux de travail pour identifier les facteurs qui peuvent jouer des rôles fonctionnels pendant l’EndMT induite par TGF-β. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier si d’autres stimuli (c’est-à-dire cytokines, facteurs de croissance, stimuli mécaniques, interactions cellule-cellule) peuvent moduler EndMT, et l’interaction de TGF-β avec d’autres stimuli. En outre, nous avons mis en évidence une approche utilisant l’édition du gène CRIPSR/Cas pour élucider si un certain gène est requis pour l’EndMT induite par TGF-β. Pour illustrer cette méthodologie, nous avons utilisé le puissant inducteur EndMT TGF-β2 dans les cellules MS-1, mais les protocoles peuvent être adaptés à d’autres cytokines et à d’autres types de cellules. Nous nous attendons à ce que ce protocole détaillé décrit serve de tremplin pour de futures études liées à l’EndMT.
The authors have nothing to disclose.
La recherche a été soutenue par CGC.NL et l’Initiative de recherche cardio-vasculaire des Pays-Bas: la Fondation néerlandaise du cœur, la Fédération néerlandaise des centres médicaux universitaires, l’Organisation néerlandaise pour la recherche et le développement en santé et la bourse de l’Académie royale des sciences des Pays-Bas accordée à Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM est soutenu par le Conseil chinois des bourses d’études. GSD est soutenu par une subvention trampoline de l’AFM-Téléthon [22379], FOP Italia et une subvention de La Fundació La Marató de TV3 (#202038).
0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |