膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察
1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine,University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine,Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida
Summary
本研究は、膵島の生理学と膵島免疫細胞相互作用の研究に生きた膵臓組織スライスを適用することを示す。
Abstract
生きた膵臓組織スライスは、膵島の生理学と、無傷の膵島微小環境の文脈での機能の研究を可能にする。スライスはアガロースに埋め込まれた生きたヒトおよびマウス膵臓組織から調製され、ビブラートメを使用して切断される。この方法は、組織が1型(T1D)および2型糖尿病(T2D)などの基礎的な病理を維持することに加えて、生存率と機能を維持することを可能にする。このスライス法は、膵臓の内分泌組織と外分泌組織を構成する複雑な構造および様々な細胞間相互作用の維持を通じて、膵臓の研究における新たな方向性を可能にする。このプロトコルは膵臓のスライス内の生きた内因性免疫細胞の染色およびタイムラプス顕微鏡を、膵臓生理学の評価と共に行う方法を示す。さらに、この手法は、主要な組織適合性複合体多体試薬を用いて、小島細胞抗原に特異的な免疫細胞集団を識別するように精製することができる。
Introduction
膵臓の関与は、膵炎、T1D、およびT2D1,2,3などの疾患に対する病理性である。孤立した小島における機能の研究は、通常、周囲の環境4から小島を除去することを含む。生きた膵臓組織スライス法は、膵臓組織の研究を可能にし、膵臓の微小環境をそのまま維持し、ストレスの多い膵島分離手順の使用を回避するために開発されました。ヒトドナー組織からの膵組織スライスはT1Dの研究に成功し、免疫細胞浸潤に加えてベータ細胞喪失および機能不全のプロセスを実証した8,9,10,11,12,13。生きた膵臓組織スライス法は、マウスおよびヒト膵組織の両方に適用することができる5,6,8。臓器提供組織からのヒト膵臓組織スライスは、糖尿病を有する膵臓臓器提供者ネットワーク(nPOD)との共同研究を通じて得られる。マウススライスは、さまざまなマウス株から生成することができます。
このプロトコルは、非肥満糖尿病-再結合活性化遺伝子-1-ヌル(NOD.ラグ1—)およびT細胞受容体トランスジェニック(AI4)(NOD.ラグ1-/-.AI4 α/β)マウス株。頷く。Rag1-/- マウスは、組換え活性化遺伝子1(Rag1)14の破壊によりT細胞およびB細胞を発達させることができない。頷く。ラグ1-/-.AI4 α/β マウスは、インスリンのエピトープを標的とする単一のT細胞クローンを産生し、一貫した小地浸潤および急速な疾患開発をもたらすため、加速1型糖尿病のモデルとして使用されます15。ここで取り上げたプロトコルは、共焦点顕微鏡法の適用を通じて、生きたヒトおよびマウス膵スライスを用いた機能および免疫学的研究の手順を説明する。本明細書に記載されている技術には、生存率評価、小口同定および位置、細胞細胞細胞Ca2+ 記録、ならびに免疫細胞集団の染色および同定が含まれる。
Protocol
注:マウスを使用するすべての実験的プロトコルは、フロリダ大学動物ケア使用委員会(201808642)によって承認されました。両方の男女の組織ドナーからのヒト膵臓切片は、糖尿病を有する膵臓ドナー(nPOD)組織バンク、フロリダ大学の組織バンクのためのネットワークを介して得られた。ヒト膵臓は、臓器提供法および規制に従ってnPODと提携する認定臓器調達機関によってカダベリック臓器提供…
Representative Results
このプロトコルは、機能研究と免疫細胞の記録の両方に適した生きた膵臓組織スライスを生み出す。明視野と反射光の下の両方でスライスの外観を図1A,Bに示します。議論したように、小島は、インスリン含有量(図1C)のために発生する粒度の増加による反射光を使用したスライスに見つけることができ、反射光が使用される場合にはバ…
Discussion
このプロトコルの目的は、膵臓スライスの生成と機能および免疫学的研究でスライスを採用するために必要な手順を説明することです。生きた膵スライスを使用するには多くの利点があります。しかし、記載された実験プロトコルの間に組織が生存可能で有用であり続けるために不可欠ないくつかの重要なステップがあります。迅速に作業することが不可欠です。膵臓を注入し、ビブラート?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH助成金R01 DK123292、T32 DK108736、UC4 DK104194、UG3 DK122638、およびP01 AI042288によって資金提供されました。この研究は、糖尿病を有する膵臓臓器提供者のためのネットワークの支援を受けて行われました (nPOD;RRID:SCR_014641)、JDRF(nPOD:5-SRA-2018-557-Q-R)とレオナM.&ハリーB.ヘルムズリー慈善信託(グラント#2018PG-T1D053)が主催する共同1型糖尿病研究プロジェクト。表現された内容と見解は著者の責任であり、必ずしもnPODの公式見解を反映しているわけではありません。nPODと提携し、研究リソースを提供する臓器調達機関(OPO)を http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ に掲載しています。マウススライスの生成に使用されるビブラートを提供してくれた、フロリダ大学のケビン・オットー博士に感謝します。
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
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Cite This Article
Huber, M. K., Drotar, D. M., Hiller, H., Beery, M. L., Joseph, P., Kusmartseva, I., Speier, S., Atkinson, M. A., Mathews, C. E., Phelps, E. A. Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62207, doi:10.3791/62207 (2021).