Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo
Summary
Este estudo apresenta a aplicação de fatias de tecido pancreático vivo ao estudo da fisiologia da ilhota e interações ilhotas-células imunes.
Abstract
As fatias vivas de tecido pancreático permitem o estudo da fisiologia da ilhota e funcionam no contexto de um microambiente de ilhotas intactos. As fatias são preparadas a partir de tecido pancreático humano vivo e rato embutido em agarose e cortado usando um vibratome. Este método permite que o tecido mantenha viabilidade e função, além de preservar patologias subjacentes como diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D). O método de fatia permite novas direções no estudo do pâncreas através da manutenção das estruturas complexas e de diversas interações intercelulares que compõem os tecidos endócrinos e exócrinos do pâncreas. Este protocolo demonstra como realizar a coloração e microscopia de lapso de tempo de células imunes endógenas vivas dentro de fatias pancreáticas, juntamente com avaliações da fisiologia da ilhota. Além disso, essa abordagem pode ser refinada para discernir populações de células imunes específicas para antígenos de células ilhotas usando grandes reagentes complexos-multimers de histocompatibilidade.
Introduction
O envolvimento do pâncreas é pathognomônico a doenças como pancreatite, T1D e T2D1,2,3. O estudo da função em ilhotas isoladas geralmente envolve a remoção das ilhotas de seu ambiente circundante4. O método de fatia de tecido pancreático vivo foi desenvolvido para permitir o estudo do tecido pancreático, mantendo microambientes intactos de ilhotas e evitando o uso de procedimentos estressantes de isolamento de ilhotas5,6,7. Fatias de tecido pancreático do tecido doador humano têm sido usadas com sucesso para estudar T1D e demonstraram processos de perda e disfunção de células beta, além da infiltração de células imunes8,9,10,11,12,13. O método de fatia de tecido pancreático vivo pode ser aplicado tanto no tecido pancreático humano5,6,8. As fatias de tecido pancreático humano de tecidos doadores de órgãos são obtidas através de uma colaboração com a Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD). As fatias do mouse podem ser geradas a partir de uma variedade de cepas diferentes de mouse.
Este protocolo se concentrará na recombinação diabética não obesa ativando gene-1-nulo (NOD). Rag1-/-) e receptor de células T transgênicos (AI4) (NOD. Rag1-/-. Cepas de camundongos AI4 α/β). ACENO. Os camundongos são incapazes de desenvolver células T e B devido a uma interrupção no gene ativador de recombinação 1 (Rag1)14. ACENO. Rag1-/-. Camundongos aI4 α/β são usados como modelo para diabetes tipo 1 acelerado porque produzem um único clone de células T que tem como alvo um epítope de insulina, resultando em infiltração consistente de ilhotas e desenvolvimento rápido de doenças15. O protocolo aqui apresentado descreve procedimentos para estudos funcionais e imunológicos utilizando fatias pancreáticas humanas e de camundongos vivas através da aplicação de abordagens de microscopia confocal. As técnicas aqui descritas incluem avaliações de viabilidade, identificação e localização de ilhotas, registros citosóicos do Ca2+, bem como coloração e identificação de populações de células imunes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo deste protocolo é explicar a geração de fatias de pâncreas e os procedimentos necessários para empregar as fatias em estudos funcionais e imunológicos. Há muitos benefícios em usar fatias pancreáticas vivas. No entanto, existem várias etapas críticas que são essenciais para que o tecido permaneça viável e útil durante os protocolos de experimento descritos. É imperativo trabalhar rapidamente. O tempo entre injetar o pâncreas e gerar as fatias no vibratome deve ser minimizado para manter a viab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 e P01 AI042288. Esta pesquisa foi realizada com o apoio da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), um projeto colaborativo de pesquisa de diabetes tipo 1 patrocinado pela JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e o Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Os conteúdos e opiniões expressos são de responsabilidade de seus autores e não refletem necessariamente a visão oficial do nPOD. As Organizações de Aquisição de Órgãos (OPO) em parceria com a nPOD para fornecer recursos de pesquisa estão listadas em http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Obrigado ao Dr. Kevin Otto, universidade da Flórida, por fornecer o vibratome usado para gerar fatias de rato.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
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