살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰
1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine,University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine,Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida
Summary
이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.
Abstract
살아있는 췌장 조직 조각은 그대로 있는 작은 액상 미세 환경의 맥락에서 islet 생리학 및 기능의 연구를 허용합니다. 슬라이스는 아가로즈에 내장된 살아있는 인간과 마우스 췌장 조직에서 제조되고 진동기를 사용하여 절단합니다. 이 방법을 사용하면 조직이 타입-1(T1D) 및 타입-2 당뇨병(T2D)과 같은 근본적인 병리를 보존하는 것 외에도 생존력과 기능을 유지할 수 있게 한다. 상기 슬라이스 방법은 췌장의 내분비 및 외신 조직을 포함하는 복잡한 구조및 각종 세포간 상호작용의 유지를 통해 췌장의 연구에서 새로운 방향을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 췌장 생리학의 평가와 함께 췌장 슬라이스 내에서 살아있는 내인성 면역 세포의 염색 및 시간 경과 현미경 검사를 수행하는 방법을 보여줍니다. 또한, 이러한 접근법은 주요 조직적합성 복합-다중머 시약을 사용하여 아슬레 세포 항원을 특이화하여 면역세포 집단을 분별하기 위해 정제될 수 있다.
Introduction
췌장의 참여는 췌장염, T1D 및 T2D1,2,3과 같은 질병에 대한 병증이다. 격리된 섬에서의 기능에 대한 연구는 일반적으로 주변 환경에서 섬을 제거하는 것을 포함한다4. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 그대로 있는 유일학 소환경을 유지하고 스트레스가 많은 아슬렛 격리 절차의 사용을 피하면서 췌장 조직의 연구를 가능하게 하기 위하여 개발되었다5,6,7. 인간 기증자 조직에서 췌장 조직 조각 은 성공적으로 T1D를 연구하는 데 사용되었으며 면역 세포 침투 외에 베타 세포 손실 및 기능 장애의 과정을 입증했습니다8,9,10,11,12,13. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 마우스와 인간 췌장 조직 5,6,8 모두에 적용될 수 있다. 장기 기증자 조직에서 인간 췌장 조직 조각 당뇨병을 가진 췌장 기관 기증자를 위한 네트워크와의 협력을 통해 얻어진다 (nPOD). 마우스 슬라이스는 다양한 마우스 균주로부터 생성될 수 있다.
이 프로토콜은 비 비만 당뇨병 재조합 활성화 유전자-1-null (NOD)에 초점을 맞출 것이다. Rag1/-) 및 T 세포 수용체 형질화(AI4) (NOD. Rag1/-. AI4 α/β) 마우스 균주. 끄덕이다. Rag1/– 마우스는 재조합 활성화 유전자 1 (Rag1)14에 있는 중단 때문에 T와 B 세포를 개발할 수 없습니다. 끄덕이다. Rag1/-. AI4 α/β 마우스는 인슐린의 에피토프를 표적으로 하는 단일 T 세포 클론을 생성하기 때문에 가속형 1당뇨병을 위한 모델로 사용되며, 그 결과 일관된 축색 침투및 급속한 질병 개발15가 발생한다. 여기에 소개된 프로토콜은 공초점 현미경 접근법의 적용을 통해 살아있는 인간 및 마우스 췌장 조각을 사용하여 기능및 면역학 연구를 위한 절차를 설명합니다. 본 원에 기술된 기술은 생존 가능성 평가, 아슬렛 식별 및 위치, 세포성 Ca2+ 기록뿐만 아니라 면역 세포 집단의 염색 및 식별을 포함한다.
Protocol
참고 : 마우스를 사용하는 모든 실험 프로토콜은 플로리다 동물 관리 및 사용위원회 (201808642)의 대학에 의해 승인되었다. 두 남녀의 조직 기증자에서 인간의 췌장 섹션 당뇨병을 가진 췌장 장기 기증자에 대 한 네트워크를 통해 얻은 (nPOD) 조직 은행, 플로리다 대학. 인간 췌장은 장기 기증 법률 및 규정에 따라 nPOD와 협력하는 공인 기관 조달 조직에 의해 cadaveric 장기 기증자로부터 수확되었으며 플…
Representative Results
이 프로토콜은 기능 성 연구 와 면역 세포 기록 모두에 적합한 살아있는 췌장 조직 조각을 산출합니다. 밝은 필드와 반사된 빛의 슬라이스 모양은 그림 1A, B에 표시됩니다. 논의된 바와 같이, 섬은 인슐린 함량(도 1C)으로 인해 발생하는 세분성 으로 인해 반사된 빛을 사용하여 슬라이스에서 발견될 수 있으며, 반사광이 사용될 때 배경 조직?…
Discussion
이 프로토콜의 목적은 기능및 면역학적 연구에서 슬라이스를 사용하는 데 필요한 췌장 슬라이스 생성과 절차를 구체화하는 것입니다. 라이브 췌장 슬라이스를 사용하는 데는 많은 이점이 있습니다. 그러나, 조직이 기술된 실험 프로토콜 도중 실행 가능하고 유용한 상태를 유지하는 데 필수적인 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 신속하게 작업하는 것이 필수적입니다. 췌장을 주입하고 진동에 조?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638, P01 AI042288에 의해 지원되었다. 이 연구는 당뇨병을 가진 췌장 기관 기증자를 위한 네트워크의 지원으로 수행되었습니다 (nPOD; RRID:SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)가 후원하는 공동 타입-1 당뇨병 연구 프로젝트, 레오나 M. & 해리 B. 헬름슬리 자선 신탁 (그랜트 #2018PG-T1D053). 표현된 내용과 견해는 저자의 책임이며 반드시 nPOD에 대한 공식 적인 견해를 반영하지는 않습니다. 연구 자원을 제공하기 위해 nPOD와 협력하는 장기 조달 조직 (OPO)은 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ 나열됩니다. 마우스 조각을 생성하는 데 사용되는 진동을 제공 해 준 플로리다 대학교 케빈 오토 박사에게 감사드립니다.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
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Cite This Article
Huber, M. K., Drotar, D. M., Hiller, H., Beery, M. L., Joseph, P., Kusmartseva, I., Speier, S., Atkinson, M. A., Mathews, C. E., Phelps, E. A. Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62207, doi:10.3791/62207 (2021).