Summary
该协议最初由费尔南德斯-戈迪诺等人于2016年1月报告，描述了一种有效分离和培养小鼠RPE细胞的方法，该细胞在一周内在Transwell板上形成功能和极化的RPE单层。手术大约需要3个小时。
Abstract
眼疾影响全球数百万人，但人体组织的有限可用性阻碍了他们的研究。小鼠模型是了解眼科疾病病理生理学的有力工具，因为它们与人体解剖学和生理学相似。视网膜色素上皮（RPE）的改变，包括形态和功能的变化，是许多眼部疾病共有的共同特征。然而，成功隔离和培养原鼠RPE细胞是非常具有挑战性的。本文是费尔南德斯-戈迪诺等人之前在 2016 年发布的协议的更新视听版本，旨在有效隔离和培养主要鼠标 RPE 细胞。这种方法具有高度可重复性，并导致高度极化和色素化的 RPE 单层的坚固培养物，可在 Transwells 上保持数周。该模型为研究眼部疾病背后的分子和细胞机制开辟了新的途径。此外，它提供了一个平台，用于测试治疗方法，可用于治疗重要的眼部疾病与未满足的医疗需求，包括遗传性视网膜疾病和黄斑变性。
Introduction
该协议最初由费尔南德斯-戈迪诺等人于2016年1月报告，描述了一种有效隔离和培养小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，该细胞在一周内在Transwell板块上形成功能性和极性RPE单层。RPE 是位于神经视网膜和布鲁赫膜之间的眼睛中的单层。这一层由高度极化和色素化的上皮细胞组成，由紧密的结点连接，呈现出类似于蜂巢2的六边形形状。尽管这种明显的组织学简单，RPE执行各种功能的关键视网膜和正常的视觉周期2，3，4。RPE单层的主要功能包括光吸收、光感受器的滋养和更新、代谢端产品的去除、亚视网膜空间中的离子平衡控制以及血视网膜屏障2、3的维护。RPE在眼睛5、6、7、8、9、10、11的局部调节中也起着重要的作用。RPE的退化和/或功能障碍是许多眼部疾病的共同特征，如视网膜炎色素沉着症，勒伯先天性动脉瘤，白化病，糖尿病视网膜病变，和黄斑变性12，13，14，15。不幸的是，人体组织的可用性是有限的。鉴于小鼠与人类高度保存的遗传同源性，小鼠模型是研究眼部疾病16、17、18、19的合适和有用的工具。此外，使用培养的原发性RPE细胞提供的优势，如基因操纵和药物测试，可以加快开发新的疗法，这些危及视力的疾病9，11。
可用于鼠标 RPE 隔离和文化的现有方法缺乏可重复性，并且无法以足够的可靠性在体内重新概括 RPE 功能。细胞往往在几天内失去色素化，六角形和跨皮电阻（TER）在培养13，20。由于从小鼠身上建立这些初级RPE细胞培养是一个具有挑战性的过程，这个优化的协议已经创建基于其他协议，从大鼠和人眼分离RPE细胞21，22，23解剖小鼠的眼睛，收集RPE和培养小鼠RPE细胞在体外。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
遵循了《在眼科和视力研究中使用动物的ARVO声明》的准则。
注：这种方法已被证明对不同遗传背景的小鼠成功，包括C57BL/6J，B10。D2-Hco H2d H2-T18 c/oSnJ和白化病小鼠，在不同年龄。最好使用8到12周大的小鼠来获得RPE细胞。来自老老鼠的RPE细胞在培养中繁殖较少，而幼鼠的细胞越来越小，这就要求汇集不同动物的眼睛才能有可行的培养物。
1. 准备试剂和膜插入
- 准备以下试剂。
- 准备 HBSS-H−（无钙的 HBSS，无镁缓冲器 + 10 mM HEPES）：将 1 mL 的 1 M HEPES 添加到 99 mL HBSS - （无 Ca/Mg） 缓冲区。存储在4°C至1个月。
- 准备 HBSS-H+ （含钙的 HBSS，含镁缓冲器 + 10 mM HEPES）：将 1 mL 的 1 M HEPES 添加到 99 mL HBSS® （含 Ca/Mg） 缓冲区。存储在4°C至1个月。
- 准备透明质溶液（1毫克/mL）：将10毫克透明质酶添加到10毫升的HBSS-H−并使用10mL注射器使用0.4微米无菌注射器过滤器进行过滤。使用前准备新鲜，并在室温下离开（RT：20-25°C）。
- 准备 FBS 解决方案：将 20% 的 FBS 与 HBS-H+ 混合。将 2 毫升 FBS 添加到 8 毫升的 HBS-H+ 中。使用前准备新鲜。
- 准备 RPE 介质： N1 中等补充 1/100 （v/v）， 谷氨酰胺 1/100 （v/v）， 青霉素链霉素 1/100 （v/v） 和非必要氨基酸溶液 1/100 （v/v） ），氢皮质松 （20μg/L）， 陶林 （250 毫克/升） 和三叶草 - 胸腺素 （0.013 微克/升） 在阿尔法 MEM + 5% FBS 或没有 FBS1，23，24.如果需要，FBS 可能会被热灭活：没有观察到任何差异。为 RPE 隔离准备新鲜。对于细胞培养维护，存储在4°C长达1个月。
- 准备特普辛-EDTA：准备新鲜的三丁基-EDTA（0.25%） 的小一次性别名（+8 mL）并将它们冻结在-20°C。每次使用前在RT解冻它们。避免冻结-解冻周期。
- 准备膜插入（例如，跨井插入）。
- 在 37 °C 时，在 5% 的 CO 2 -aerated 孵化器中，用 RPE 介质平衡6.5mm 膜插入至少 30 分钟。使用一个膜插入从两个鼠标的眼睛种子RPE细胞。
- 孵化后，用 700 μL 的 PBS 替换下舱的介质。
- 从顶部隔间取出介质，在 RT 处涂上 100μL 的 100μl 10 μg/mL 鼠标层蛋白（在 PBS 中），至少 2 小时（较短的孵化可能导致细胞对插入物的附着不良）。
- 涂上额外的膜插入，用作 TER 测量的空白。
2. 解剖和引诱鼠标眼睛
- 通过将小鼠放入二氧化碳室，并以每分钟30-70%的填充率缓慢释放二氧化碳，通过二氧化碳窒息使小鼠安乐死。
- 将微力的倾斜、锯齿状尖端放在鼠标眼睛的每一侧，轻轻按压以支撑眼球（诱导）。
- 关闭放置在眼球周围的钳子。然后，向前和向后移动时轻轻拉动，用视神经将整个眼睛与眼部肌肉分离，确保没有结缔组织仍然附着在硬皮上。
- 在70%乙醇中冲洗被诱导的眼球，然后将其放入一个六井板的一口井中，在冰上放置3mL的HBSS-H−。
- 重复步骤 2.2 到 2.4 以移除鼠标的第二只眼睛。在 30 分钟内继续执行后续步骤。
注：建议一次只切除两只眼睛，直到获得一些经验。
3. RPE 的集合
注意：在层压流罩的无菌条件下执行以下步骤。为了避免在冰上延长潜伏期，这可能导致 RPE 细胞死亡，一次收集不超过两只眼睛。
- 使用解剖立体显微镜，杜蒙#5钳子和斜剪刀小心地清理所有粘附在眼球上的结缔组织、血液和肌肉，而不会在囊中有任何切口。根据需要定期更换 3 mL 的 HBSS-H −缓冲器，以保持眼睛新鲜和清洁，并避免 RPE 培养物的污染。
- 使用视神经作为手柄，用锋利的碳钢#11刀片在角膜中心打一个洞。
- 使用杜蒙#5剪刀通过上述孔在角膜上切开三个切口，确保有足够的空间去除镜片。
- 抓住视神经，用斜剪刀的底座对奥拉塞拉塔施加轻微的压力，直到镜头完全出来。将虹膜上皮留在原位，以防止潜伏期间神经网膜和 RPE 的分离。将眼睛放在 HBSS-H 缓冲器中。
- 重复步骤 3.1-3.4 解剖第二只眼睛。
- 在 37 °C 的 12 井板中孵化无镜片的眼睛，在 5% CO2- 通风孵化器（1.5 mL/井）中 45 分钟，将神经视网膜从 RPE 中分离出来。
- 将每只眼睛放在一口新井中，在冰上孵育30分钟，每口油井1.5mL的冷HBSS-H+缓冲器，以阻止透明质酶活动。不要将孵化时间延长超过 45 分钟。
- 洗净，并用新鲜的 HBSS-H+ 缓冲器将每只眼睛放入 35 毫米培养皿中，然后用 8 厘米的 Vannas 剪刀切开角膜，直到到达奥拉塞拉塔。然后，切下奥拉塞拉塔，以去除虹膜上皮和角膜。
- 用弯曲的钳子保持眼杯边缘/奥拉塞拉塔，并使用倾斜的微力拉开神经视网膜，确保 RPE 层不被切割。然后，切断视神经的内部附件。如果一些 RPE 细胞仍然附着在神经网膜上，请延长潜伏时间，但总时间不超过 45 分钟。
- 切开视神经，将每个眼杯转移到不同的12井板，每口井含有1.5毫升的新鲜三氯辛-EDTA。确保眼杯保持打开，并完全淹没在肌氨脂中。在 5% 的 CO2 孵化器中，在 37 °C 孵化眼杯 45 分钟。
- 将每个眼杯与在尝试普辛孵化过程中分离的任何 RPE 表一起收集，并将其转移到包含每口油井 1.5 mL FBS 解决方案的 12 井板中。如果 RPE 表仍保留在试穿素溶液中，请使用微管将它们转移到带 FBS 解决方案的井中。
4. 隔离原鼠RPE细胞
- 将每个眼杯由视神经按住，朝下摇动到 12 井板中，其中含有 HBSS-H+ 中 20% FBS 的 1.5 mL，直到 RPE 表完全分离。
- 用微管收集任何 RPE 表和 RPE 集群，并将其放置在 15 mL 管中。避免任何白色的鳞片或巧克力，这可能会污染文化。将同一只鼠标的两只眼睛池在一个管子里。
- 在 RT 以 340 x g 的速度将混合物离心 2 分钟，然后丢弃超自然。
- 在 1 mL 的尝试素 - EDTA 中轻轻恢复 RPE 颗粒 （0.25%）并在37°C的水浴中孵育混合物1分钟，将RPE表分解成单个细胞。孵化后，用微管轻轻上下吹10次，避免在管道时形成气泡。
- 加入 9 mL 的新鲜制备 RPE 介质，以稀释和灭活 trypsin，并在 RT 以 340 x g 将混合物离心机加热 2 分钟。
- 吸气超自然，并小心地用5%FBS在150μL的RPE介质中补充细胞颗粒，确保细胞在管道管道中均匀地恢复并避免气泡形成。
- 从步骤 1.2 中插入层蛋白涂层膜，从底部腔室中去除 PBS，并添加 700 μL 的 RPE 介质。
- 从膜插入的上腔取出层蛋白，并顺流而均匀地将 RPE 细胞悬架分配到腔室的中心，避免在管道时形成气泡。
- 将膜插入 5% CO2 孵化器中，在 37 °C 时保持不受干扰，至少 24 小时。
- 24小时后，检查显微镜下的膜插入，以确保大多数 RPE 细胞连接到插入物上，汇合率至少为 50%（图 1A）。在前 72 小时内不更换媒体至关重要。
5. 极化 RPE 单层文化
- 在刷新 RPE 介质以允许细胞连接之前，在培养中保持隔离的 RPE 细胞至少 72 小时。在播种时，50%或以上的细胞汇合对于形成合适的极化 RPE 单层至关重要。
- 连接细胞后，每周使用新鲜和预热 RPE 介质（步骤 1.1.5）更改培养介质两次。血清可以在前 72 小时后从培养介质中去除。
注意：在培养一周后，细胞应是结合的，六角形的，双核的，色素和极化的（图1B），预计细胞数量约为50，000细胞每6.5毫米Transwell插入。在培养两周后，观察由健康细胞组成的RPE单层。RPE 文化显示 apical 微维利、基底折叠和紧密的交汇点 （图 1C）。
6. TER 测量
注：在培养后至少4天对RPE细胞进行TER测量，以确保RPE单层细胞的完整性和极化。
- 用70%的乙醇清洁伏特米电极，并小心干燥。
- 从孵化器取出转井，并在 3 分钟内进行 TER 测量，以避免因温度波动而发生改变。要测量 TER，请将伏托赫米短电极浸入上腔和膜插入的底部腔中。避免与 RPE 单层接触，以防止细胞分离。
- 要计算 TER，请从样品中扣除空白值（在没有细胞的情况下涂有层蛋白的膜插入）。然后乘以膜插入的表面积（0.33 厘米2 在 6.5 毫米膜插入的情况下）获得的价值（在 Ohms 中）。该产品应至少200 Ω×厘米2 后72小时的文化。两周后，TER 值应测量在 400 Ω x cm2 以上。丢弃具有低TER值的RP文化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议已被用来隔离和培养RPE细胞从转基因小鼠1。没有观察到小鼠菌株或性别之间的差异。研究结果有助于了解眼部疾病机制的一些重要方面，如与年龄有关的黄斑变性，这是老年人视力丧失的最常见原因。在此协议后分离的 RPE 细胞在播种后 24 小时内完全连接到膜插入上，并在 72 h1后显示典型的 RPE 大小、形态和色素沉着。一周后，一个高度极化的RPE单层由六角色素RPE细胞形成，两个核连接着表示ZO-1（图1C，2）的紧密交汇点。传输电子显微图揭示了阿皮奇微维利和基底折叠的存在（图1C）。RPE单层的极化得到了TER值的确认，平均值高于200 Ω×厘米2，随着时间的推移保持稳定（图2）。
通过噬菌体分析对该方法进行功能验证。鼠标RPE细胞在膜插入物上培养，并配以FITC标记的牛POS喂养。 POS的吞没和消化通过荧光显微镜（图3）进行证明。
图1。不同时间点的 RPE 单元格。 （A） RPE细胞的10倍亮场显微图24小时后在膜插入上播种，和（B）一周后。（C） 传输电子显微图在膜插入物上显示 RPE 培养的 apical 微维利、基底折叠和黑色素颜料（黑点），为期两周。比例栏：A，B：100μm，C：2μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。随着时间的推移。 在膜插入上测量了 +60 个主要鼠标 RPE 细胞培养物的跨皮电阻 （TER），在 0.5 （n=33）、1 （n=58）、1.5 （n=54） 和 2 （n=60） 周后进行测量。TER 在 72 小时内达到 200 Ω x cm2 以上，并且至少稳定两周。数据表示为具有平均± SD 的单个值。 请单击此处查看此图的更大版本。
图3。噬菌体病检测。40倍的荧光显微图的主要小鼠RPE培养物喂养与FITC标签牛POS（绿色）两个小时，并固定与甲醇25。较小的碎片对应于细胞细胞质内消化的POS。像之前描述的1、9，免疫与抗体抗ZO1一起促进紧密路口（红色）的可视化。DAPI（蓝色）用于染色核。在图像中心可以观察到具有两个核的典型鼠标 RPE 细胞。比例栏： 50μm.请单击此处查看此图的更大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
虽然在1、13、20、22、26、27之前已经开发出几种小鼠RPE细胞分离和培养方法，但费尔南德斯-戈迪诺的方法首先使用膜插入，使RPE细胞在培养中的有效生长长达1周，即9周。他们的协议1，9的另一个主要变化是使用酶溶液，而不是机械剥离分离RPE细胞1，13，20，26。镜片通过角膜切口去除，使虹膜上皮完好无损，并在第一次孵化期间保持小灵通的完整性。RPE细胞的温和隔离与膜插入和特定RPE介质23的使用相结合，提高了细胞的存活率，增强了功能组合单层的形成，在培养物2的几天内模仿RPE的生理条件。通常，用这种方法培养的原发性小鼠 RPE 细胞会显示六边形形态、极化、色素化、屏障特性和增殖。此外，RPE可以在血清没有的情况下培养，从第三天到几个星期，这是重要的研究补充相关的RPE病理学9。
此协议的一个限制是，在膜插入上培养的主要鼠标 RPE 细胞无法扩展。通过主要小鼠RPE细胞与酶溶液或培养他们很长一段时间导致色素化损失，去分化，并减少TER，从而失去类似于 体内特征的 特性。从一种动物身上获得的RPE细胞数量有限，需要从不同动物中采集样本进行转录和蛋白质组分析，因为那里需要相对大量的启动材料。不建议通过将更多的眼睛集中到更大的膜插入中来扩展 RPE 文化，因为它可能导致更高的细胞死亡百分比和多层 RPE 培养。
协议也有一些关键步骤。在获得一些经验之前，不应同时收获超过两只眼睛，因为长时间的解剖会导致细胞死亡的百分比更高。视神经必须切断之前，孵育与肌素。在不干扰 RPE 细胞的情况下处理眼杯至关重要，但视神经会被肌肽消化，这会导致 RPE 培养物中的杂质。必须小心地去皮掉眼部肌肉。如果硬膜穿孔，神经视网膜弹出，眼睛必须丢弃，因为RPE细胞将被损坏，将无法生存。应施加最小的压力来取出镜片。最好进行较大的角膜切口。眼杯必须打开并完全浸入肌肽中，以便所有 RPE 细胞都暴露在溶液中。RPE细胞必须通过眼杯的轻轻摇动来收集，并且绝不能通过喷洒介质或机械剥落它们来收集。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了麻省眼耳眼科基因组研究所的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
