3D-Druck von In-vitro-Hydrogel-Mikroträgern durch abwechselnd viskos-inertiales Kraft-Jetting
Summary
Hier wird eine milde 3D-Drucktechnik vorgestellt, die durch abwechselnd viskos-inertiale Kräfte angetrieben wird, um den Bau von Hydrogel-Mikroträgern zu ermöglichen. Hausgemachte Düsen bieten Flexibilität und ermöglichen einen einfachen Austausch für verschiedene Materialien und Durchmesser. Zellbindende Mikroträger mit einem Durchmesser von 50-500 μm können erhalten und für die weitere Kultivierung gesammelt werden.
Abstract
Microcarrier sind Kügelchen mit einem Durchmesser von 60-250 μm und einer großen spezifischen Oberfläche, die üblicherweise als Träger für großflächige Zellkulturen verwendet werden. Die Mikrocarrierkulturtechnologie ist zu einer der Haupttechniken in der zytologischen Forschung geworden und wird häufig im Bereich der großflächigen Zellexpansion eingesetzt. Es hat sich auch gezeigt, dass Mikrocarrier eine immer wichtigere Rolle bei der In-vitro-Tissue-Engineering-Konstruktion und beim klinischen Arzneimittelscreening spielen. Aktuelle Methoden zur Herstellung von Mikrocarriern umfassen mikrofluidische Chips und Tintenstrahldruck, die oft auf einem komplexen Strömungskanaldesign, einer inkompatiblen Zweiphasenschnittstelle und einer festen Düsenform beruhen. Diese Methoden stehen vor den Herausforderungen komplexer Düsenverarbeitung, unbequemer Düsenwechsel und übermäßiger Extrusionskräfte, wenn sie auf mehrere Biotinten angewendet werden. In dieser Studie wurde eine 3D-Drucktechnik, die als alternierende viskos-inertiale Kraftstrahlung bezeichnet wird, angewendet, um den Bau von Hydrogel-Mikroträgern mit einem Durchmesser von 100-300 μm zu ermöglichen. Anschließend wurden Zellen auf Mikroträgern ausgesät, um Tissue-Engineering-Module zu bilden. Im Vergleich zu bestehenden Verfahren bietet diese Methode einen freien Düsenspitzendurchmesser, flexibles Düsenschalten, freie Kontrolle der Druckparameter und milde Druckbedingungen für eine Vielzahl von bioaktiven Materialien.
Introduction
Mikroträger sind Kügelchen mit einem Durchmesser von 60-250 μm und einer großen spezifischen Oberfläche und werden üblicherweise für die großflächige Kultur von Zellen verwendet1,2. Ihre äußere Oberfläche bietet reichlich Wachstumsstellen für Zellen, und das Innere bietet eine Stützstruktur für die räumliche Proliferation. Die sphärische Struktur bietet auch Komfort bei der Überwachung und Kontrolle von Parametern, einschließlich pH-Wert, O2 und Konzentration von Nährstoffen und Metaboliten. In Kombination mit Rührkessel-Bioreaktoren können Mikrocarrier im Vergleich zu herkömmlichen Kulturen höhere Zelldichten in einem relativ kleinen Volumen erreichen und bieten damit eine kostengünstige Möglichkeit, Großkulturen zu erhalten3. Die Mikroträgerkulturtechnologie ist zu einer der wichtigsten Techniken in der zytologischen Forschung geworden, und auf dem Gebiet der großflächigen Expansion von Stammzellen, Hepatozyten, Chondrozyten, Fibroblasten und anderen Strukturen wurden große Fortschritte erzielt4. Sie haben sich auch als ideale Arzneimittelverabreichungsvehikel und Bottom-up-Einheiten erwiesen und übernehmen daher eine immer wichtigere Rolle beim klinischen Arzneimittelscreening und bei der Reparatur von In-vitro-Geweben5.
Um die Anforderungen an die mechanischen Eigenschaften in verschiedenen Szenarien zu erfüllen, wurden mehrere Arten von Hydrogelmaterialien für den Bau von Mikrocarriern entwickelt6,7,8,9,10,11. Alginat- und Hyaluronsäure (HA)-Hydrogele sind aufgrund ihrer guten Biokompatibilität und Vernetzungsfähigkeit zwei der am häufigsten verwendeten Mikrocarriermaterialien12,13. Alginat kann leicht durch Calciumchlorid vernetzt werden, und seine mechanischen Eigenschaften können durch Änderung der Vernetzungszeit moduliert werden. Tyramin-konjugiertes HA wird durch die oxidative Kopplung von Tyraminresten, die durch Wasserstoffperoxid und Meerrettichperoxidase katalysiert werden, vernetzt14. Kollagen wird aufgrund seiner einzigartigen Spiralstruktur und seines vernetzten Fasernetzwerks häufig als Adjuvans verwendet, um sich in die Mikroträger zu mischen, um die Zellbindung weiter zu fördern15,16.
Aktuelle Methoden zur Herstellung von Mikrocarriern umfassen mikrofluidische Chips, Tintenstrahldruck und Elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidische Chips haben sich bei der Herstellung von Mikrocarriern in einheitlicher Größe als schnell und effizient erwiesen24. Diese Technologie beruht jedoch auf einem komplexen Fließkanaldesign- und Fertigungsprozess25. Hohe Temperaturen oder übermäßige Extrusionskräfte beim Tintenstrahldruck sowie intensive elektrische Felder beim Elektrospray-Ansatz können die Eigenschaften des Materials, insbesondere seine biologische Aktivität, beeinträchtigen19. Wenn sie auf verschiedene Biomaterialien und Durchmesser angewendet werden, führen die in diesen Methoden verwendeten kundenspezifischen Düsen zu einer begrenzten Verarbeitungskomplexität, hohen Kosten und geringer Flexibilität.
Um eine bequeme Methode für die Mikrocarrier-Vorbereitung bereitzustellen, wurde eine 3D-Drucktechnik namens Alternating Viscous-Inertial Forces Jetting (AVIFJ) angewendet, um Hydrogel-Mikroträger zu konstruieren. Die Technik nutzt nach unten gerichtete Antriebskräfte und statischen Druck, die während vertikaler Vibrationen erzeugt werden, um die Oberflächenspannung der Düsenspitze zu überwinden und so Tröpfchen zu bilden. Anstelle von starken Kräften und thermischen Bedingungen wirken kleine schnelle Verschiebungen während des Druckens direkt auf die Düse, was einen geringen Einfluss auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Biotinte hat und eine große Anziehungskraft auf bioaktive Materialien ausübt. Mit der AVIFJ-Methode wurden mikrocarrier aus mehreren Biomaterialien mit Durchmessern von 100-300 μm erfolgreich gebildet. Außerdem wurde bewiesen, dass die Mikrocarrier Zellen gut binden und eine geeignete Wachstumsumgebung für adhärente Zellen bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll enthält Anweisungen für die Herstellung von Multitypen von Hydrogel-Mikroträgern und die anschließende Zellaussaat. Im Vergleich zu mikrofluidischen Chip- und Inkjet-Druckverfahren bietet der AVIFJ-Ansatz zum Bau von Mikrocarriern eine größere Flexibilität und Biokompatibilität. Eine unabhängige Düse ermöglicht den Einsatz einer breiten Palette von Leichtbaudüsen, einschließlich Glasmikropipetten, in diesen Drucksystemen. Die hochgradig kontrollierbare Verarbeitung ermöglicht…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Beijing Natural Science Foundation (3212007), dem Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), dem Spring Breeze Fund der Tsinghua University (20201080760), der National Natural Science Foundation of China (51805294), dem National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) und dem 111 Project (B17026) unterstützt.
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
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