Здесь представлена мягкая техника 3D-печати, управляемая чередующимися вязко-инерционными силами, позволяющая строить гидрогелевые микроносители. Самодельные насадки обеспечивают гибкость, что позволяет легко заменять различные материалы и диаметры. Микроносители клеточного связывания диаметром 50-500 мкм могут быть получены и собраны для дальнейшего культивирования.
Микроносители представляют собой шарики диаметром 60-250 мкм и большой удельной площадью поверхности, которые обычно используются в качестве носителей для крупномасштабных клеточных культур. Технология микронесущих культур стала одним из основных методов в цитологических исследованиях и широко используется в области крупномасштабного расширения клеток. Было также показано, что микроносители играют все более важную роль в построении тканевой инженерии in vitro и клиническом скрининге лекарств. Современные методы подготовки микронесущих включают микрофлюидные чипы и струйную печать, которые часто полагаются на сложную конструкцию канала потока, несовместимый двухфазный интерфейс и фиксированную форму сопла. Эти методы сталкиваются с проблемами сложной обработки сопла, неудобными изменениями сопла и чрезмерными экструзионными силами при применении к нескольким биочернам. В этом исследовании был применен метод 3D-печати, называемый чередующимся вязко-инерционным струйным действием, чтобы позволить построить гидрогелевые микроносители диаметром 100-300 мкм. Впоследствии клетки были посеяны на микроносителях для формирования тканевых инженерных модулей. По сравнению с существующими методами, этот метод предлагает свободный диаметр наконечника сопла, гибкое переключение сопел, свободное управление параметрами печати и мягкие условия печати для широкого спектра биологически активных материалов.
Микроносители представляют собой шарики диаметром 60-250 мкм и большой удельной площадью поверхности и обычно используются для крупномасштабной культивирования клеток1,2. Их внешняя поверхность обеспечивает обильные участки роста для клеток, а внутренняя обеспечивает опорную структуру для пространственной пролиферации. Сферическая структура также обеспечивает удобство в мониторинге и контроле параметров, включая pH, O2 и концентрацию питательных веществ и метаболитов. При использовании в сочетании с биореакторами с перемешиваемым резервуаром микроносители могут достигать более высокой плотности клеток в относительно небольшом объеме по сравнению с обычными культурами, тем самым обеспечивая экономически эффективный способ получения крупномасштабных культур3. Технология культивирования микроносителей стала одним из основных методов в цитологических исследованиях, и большой прогресс был достигнут в области масштабного расширения стволовых клеток, гепатоцитов, хондроцитов, фибробластов и других структур4. Было также установлено, что они являются идеальными средствами доставки лекарств и блоками снизу вверх, поэтому они играют все более важную роль в клиническом скрининге лекарств и восстановлении тканевой инженерии in vitro5.
Для удовлетворения требований к механическим свойствам в различных сценариях было разработано несколько типов гидрогелевых материалов для использования в строительстве микронесущих6,7,8,9,10,11. Гидрогели альгината и гиалуроновой кислоты (ГК) являются двумя наиболее часто используемыми микронесущими материалами благодаря их хорошей биосовместимости и сшиваемости12,13. Альгинат может быть легко сшит хлористым кальцием, а его механические свойства могут модулироваться путем изменения времени сшивания. Тирамино-конъюгированная ГК сшита окислительной связью фрагментов тирамина, катализируемых перекисью водорода и пероксидазой хрена14. Коллаген, благодаря своей уникальной спиральной структуре и сшитой волоконной сети, часто используется в качестве адъюванта для смешивания с микроносителями для дальнейшего содействия прикреплению клеток15,16.
Современные методы подготовки микроносителей включают микрофлюидные чипы, струйную печать и электрораспыление17,18,19,20,21,22,23. Было доказано, что микрофлюидные чипы быстро и эффективно производят микроносители однородного размера24. Однако эта технология опирается на сложный процесс проектирования и изготовления каналов потока25. Высокая температура или чрезмерные экструзионные силы при струйной печати, а также интенсивные электрические поля при электрораспылительном подходе могут негативно сказаться на свойствах материала, особенно на его биологической активности19. Кроме того, при применении к различным биоматериалам и диаметрам индивидуальные сопла, используемые в этих методах, приводят к ограниченной сложности обработки, высокой стоимости и низкой гибкости.
Чтобы обеспечить удобный метод подготовки микроносителей, для построения гидрогелевых микроносителей был применен метод 3D-печати, называемый струйной обработкой переменных вязко-инерционных сил (AVIFJ). Техника использует нисходящие движущие силы и статическое давление, создаваемое во время вертикальной вибрации, чтобы преодолеть поверхностное натяжение наконечника сопла и, таким образом, сформировать капли. Вместо сильных сил и тепловых условий небольшие быстрые смещения действуют непосредственно на сопло во время печати, оказывая незначительное влияние на физико-химические свойства биочернила и представляя большую привлекательность для биологически активных материалов. С помощью метода AVIFJ были успешно сформированы микроносители из нескольких биоматериалов диаметром 100-300 мкм. Кроме того, было доказано, что микроносители хорошо связывают клетки и обеспечивают подходящую среду роста для прилипших клеток.
Протокол, описанный здесь, содержит инструкции по приготовлению многотипных микроносителей гидрогеля и последующему посеву клеток. По сравнению с методами микрофлюидной чиповой и струйной печати, подход AVIFJ к созданию микронесущих обеспечивает большую гибкость и биосовместимость. Н?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Пекинским фондом естественных наук (3212007), Программой научных исследований Инициативы Университета Цинхуа (20197050024), Фондом весеннего бриза Университета Цинхуа (20201080760), Национальным фондом естественных наук Китая (51805294), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0703004) и Проектом 111 (B17026).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Gelatin | SIGMA | G1890 | |
Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
Puller | sutter instrument | P-1000 | |
Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |