交互の粘性慣性力噴射による インビトロ ヒドロゲルマイクロキャリアの3D印刷

Summary

ここでは、ヒドロゲルマイクロキャリアの構築を可能にするために、粘性慣性力を交互に駆動する穏やかな3D印刷技術を紹介します。自家製ノズルは柔軟性を提供し、異なる材料や直径を簡単に交換できます。直径50〜500μmの細胞結合マイクロ担体を取得し、さらなる培養のために回収することができる。

Abstract

マイクロキャリアは、直径60~250μm、比表面積の大きいビーズで、大規模細胞培養用担体として一般的に使用されています。マイクロキャリア培養技術は、細胞学的研究における主要な技術の1つとなっており、大規模な細胞増殖の分野で一般的に使用されている。マイクロキャリアはまた、 インビトロ 組織工学構築および臨床薬物スクリーニングにおいてますます重要な役割を果たすことが示されている。マイクロキャリアを調製するための現在の方法には、マイクロ流体チップおよびインクジェット印刷が含まれ、これらはしばしば複雑な流路設計、互換性のない二相界面、および固定ノズル形状に依存する。これらの方法は、複雑なノズル加工、不便なノズル交換、および複数のバイオインクに適用した場合の過度の押出力の課題に直面しています。本研究では、直径100~300μmのハイドロゲルマイクロキャリアの構築を可能にするために、交互粘性慣性力噴射と呼ばれる3Dプリンティング技術を適用した。その後、細胞をマイクロキャリア上に播種し、組織工学モジュールを形成した。既存の方法と比較して、この方法は、幅広い生物活性材料に対して、自由なノズル先端直径、柔軟なノズル切り替え、印刷パラメータの自由な制御、および穏やかな印刷条件を提供する。

Introduction

マイクロキャリアは、直径60~250μm、比表面積の大きいビーズで、細胞の大規模培養に一般的に使用されています^1,2。それらの外表面は細胞に豊富な増殖部位を提供し、内部は空間的増殖のための支持構造を提供する。球状構造はまた、pH、_O2、栄養素および代謝産物の濃度を含むパラメータの監視および制御において利便性を提供する。撹拌槽バイオリアクターと組み合わせて使用すると、マイクロキャリアは従来の培養物と比較して比較的少量でより高い細胞密度を達成することができ、それによって大規模培養を達成するための費用対効果の高い方法を提供する³。マイクロキャリア培養技術は、細胞学的研究における主要な技術の一つとなっており、幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、線維芽細胞などの大規模増殖の分野では大きな進歩を遂げています⁴。また、理想的な薬物送達ビヒクルおよびボトムアップユニットであることも判明しており、臨床薬物スクリーニングおよびインビトロ組織工学修復においてますます重要な役割を果たしています⁵。

異なるシナリオにおける機械的特性要件を満たすために、マイクロキャリアの構築に使用するために複数のタイプのヒドロゲル材料が開発されている6,7,8,9,10,11。アルギン酸およびヒアルロン酸(HA)ヒドロゲルは、その良好な生体適合性および架橋性のために、最も使用されるマイクロ担体材料の^{2つである12,13}。アルギン酸塩は塩化カルシウムによって容易に架橋することができ、その機械的特性は架橋時間を変えることによって調節することができる。チラミン共役HAは、過酸化水素および西洋ワサビペルオキシダーゼによって触媒されるチラミン部分の酸化的結合によって架橋される¹⁴。コラーゲンは、その独特のスパイラル構造と架橋繊維ネットワークのために、細胞付着をさらに促進するためにマイクロキャリアに混合するためのアジュバントとしてしばしば使用される^15,16。

マイクロキャリアを調製するための現在の方法には、マイクロ流体チップ、インクジェット印刷、およびエレクトロ^{スプレー17}、^18、19、20、²¹、^22、23が含まれる。マイクロ流体チップは、均一なサイズのマイクロキャリアを製造するのに迅速かつ効率的であることが証明されています²⁴。しかし、この技術は複雑な流路の設計と製造プロセスに依存しています²⁵。インクジェット印刷中の高温または過剰な押出力、ならびにエレクトロスプレーアプローチにおける強烈な電界は、材料の特性、特にその生物学的活性に悪影響を及ぼす可能性がある¹⁹。さらに、さまざまな生体材料および直径に適用すると、これらの方法で使用されるカスタマイズされたノズルは、処理の複雑さ、高コスト、および柔軟性の低下を限定する。

マイクロ担体調製のための便利な方法を提供するために、交互粘性慣性力噴射(AVIFJ)と呼ばれる3D印刷技術がヒドロゲルマイクロキャリアを構築するために適用されている。この技術は、垂直振動時に発生する下向きの駆動力と静圧を利用してノズル先端の表面張力を克服し、液滴を形成する。厳しい力や熱条件の代わりに、小さな急激な変位が印刷中にノズルに直接作用し、バイオインクの物理化学的特性にわずかな影響を与え、生物活性材料に大きな魅力をもたらします。AVIFJ法を利用して、直径100~300μmの複数の生体材料のマイクロキャリアの形成に成功しました。その上、マイクロキャリアは、細胞によく結合し、接着した細胞に適切な増殖環境を提供することがさらに証明された。

Protocol

1. 細胞培養 高グルコースダルベッコの改変最小必須培地(H-DMEM)を、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸溶液(NEAA)、1%ペニシリンGおよびストレプトマイシン、および1%グルタミンサプリメントでA549細胞の培養培地として補充する。 A549細胞を37°CのCO2インキュベーターで5%のCO2で培養する 継代培養のために細胞を約80%のコンフルエントでトリプシンを用…

Representative Results

さまざまな収束速度と直径のプリントヘッドが製造され、複数のタイプの材料の印刷が実現しました。引っ張り強度の増加に伴って得られたノズルを 図1Bに示す。ノズルは、リザーバ(III)、収縮(II)、およびプリントヘッド(I)の3つの領域に分割された。リザーバはノズルの未処理部分であり、液体が静圧を提供し、印刷用のバイオインク入力を行った。収縮領域は、下向…

Discussion

ここで説明するプロトコールは、マルチタイプのヒドロゲルマイクロキャリアの調製およびその後の細胞播種のための指示を提供する。マイクロ流体チップおよびインクジェット印刷方法と比較して、マイクロキャリアを構築するためのAVIFJアプローチは、より大きな柔軟性および生体適合性を提供する。独立したノズルにより、ガラスマイクロピペットを含む幅広い軽量ノズルをこれらの?…

Materials

A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867