Apresentada aqui é uma técnica de impressão 3D leve impulsionada por forças viscosas-inerciais alternadas para permitir a construção de microcarriers de hidrogel. Bicos caseiros oferecem flexibilidade, permitindo fácil substituição para diferentes materiais e diâmetros. Microcarriers de ligação celular com diâmetro de 50-500 μm podem ser obtidos e coletados para posterior cultivo.
Microcarriers são contas com um diâmetro de 60-250 μm e uma grande área de superfície específica, que são comumente usadas como portadores para culturas celulares de grande escala. A tecnologia da cultura microcarrier tornou-se uma das principais técnicas em pesquisa citológica e é comumente usada no campo da expansão celular em larga escala. Microcarriers também têm mostrado desempenhar um papel cada vez mais importante na construção de engenharia de tecidos in vitro e na triagem clínica de medicamentos. Os métodos atuais para preparar microcarriers incluem chips microfluidos e impressão de jato de tinta, que muitas vezes dependem de design complexo de canais de fluxo, uma interface de duas fases incompatível e uma forma de bocal fixo. Esses métodos enfrentam os desafios do processamento complexo do bico, mudanças inconvenientes no bocal e forças excessivas de extrusão quando aplicados a vários bioink. Neste estudo, foi aplicada uma técnica de impressão 3D, chamada de jato de força viscosa-inercial alternada, para permitir a construção de microcarriers de hidrogel com diâmetro de 100-300 μm. As células foram posteriormente semeadas em microcarriers para formar módulos de engenharia de tecidos. Em comparação com os métodos existentes, este método oferece um diâmetro de ponta de bocal gratuito, comutação flexível do bocal, livre controle dos parâmetros de impressão e condições de impressão suaves para uma ampla gama de materiais bioativos.
Microcarriers são contas com um diâmetro de 60-250 μm e uma grande área de superfície específica e são comumente usadas para cultura em larga escala de células1,2. Sua superfície externa fornece locais de crescimento abundantes para as células, e o interior fornece uma estrutura de suporte para a proliferação espacial. A estrutura esférica também proporciona comodidade no monitoramento e controle de parâmetros, incluindo pH, O2 e concentração de nutrientes e metabólitos. Quando usados em combinação com bioreatores de tanques agitados, os microcarriers podem alcançar densidades celulares mais altas em um volume relativamente pequeno em comparação com as culturas convencionais, fornecendo assim uma maneira econômica de alcançar culturas em larga escala3. A tecnologia da cultura microcarrier tornou-se uma das principais técnicas da pesquisa citológica, e muito progresso tem sido feito no campo da expansão em larga escala de células-tronco, hepatócitos, condrócitos, fibroblastos e outras estruturas4. Também foram encontrados veículos ideais de entrega de drogas e unidades de baixo para cima, assumindo, portanto, um papel cada vez mais importante na triagem clínica de medicamentos e reparação de tecido in vitro5.
Para atender aos requisitos de propriedade mecânica em diferentes cenários, vários tipos de materiais hidrogel foram desenvolvidos para uso na construção de microcarriers6,7,8,9,10,11. Os hidrogéis de ácido alginato e hialurônico (HA) são dois dos materiais microcarrier mais utilizados devido à sua boa biocompatibilidade e crosslinkability12,13. O alginato pode ser facilmente cruzado por cloreto de cálcio, e suas propriedades mecânicas podem ser moduladas alterando o tempo de ligação cruzada. A HA conjugada com tyramina é cruzada pelo acoplamento oxidativo de moieties de tiranaina catalisadas por peróxido de hidrogênio e peroxidase de rabanete14. O colágeno, devido à sua estrutura espiral única e rede de fibras cruzadas, é frequentemente usado como um adjuvante para se misturar nos microcarriers para promover ainda mais o apego celular15,16.
Os métodos atuais de preparação de microcarriers incluem chips microfluidos, impressão a jato de tinta e eletrospray17,18,19,20,21,22,23. Os chips microfluidos têm sido comprovadamente rápidos e eficientes na produção de microcarriers de tamanho uniforme24. No entanto, essa tecnologia conta com um complexo processo de design e fabricação de canais de fluxo25. Forças de alta temperatura ou extrusão excessiva durante a impressão de jato de tinta, bem como campos elétricos intensos na abordagem eletrospray, podem afetar negativamente as propriedades do material, especialmente sua atividade biológica19. Além disso, quando aplicados a diversos biomateriais e diâmetros, os bicos personalizados utilizados nesses métodos resultam em complexidade de processamento limitada, alto custo e baixa flexibilidade.
Para fornecer um método conveniente para a preparação de microcarrier, uma técnica de impressão 3D chamada alternando forças viscosas-inerciais (AVIFJ) foi aplicada para construir microcarriers de hidrogel. A técnica utiliza forças motrizes descendentes e pressão estática gerada durante a vibração vertical para superar a tensão superficial da ponta do bocal e, assim, formar gotículas. Em vez de forças severas e condições térmicas, pequenos deslocamentos rápidos atuam diretamente no bocal durante a impressão, causando um pequeno efeito sobre as propriedades físico-químicas do bioink e apresentando grande atração por materiais bioativos. Utilizando o método AVIFJ, microcarriers de múltiplos biomateriais com diâmetros de 100-300 μm foram formados com sucesso. Além disso, as microcarriers foram comprovadamente mais adequadas para ligar bem as células e proporcionar um ambiente de crescimento adequado para as células aderidas.
O protocolo descrito aqui fornece instruções para a preparação de multi-tipos de microcarriers de hidrogel e subsequentes semeadura de células. Em comparação com os métodos microfluídicos de impressão de chips e jatos de tinta, a abordagem AVIFJ para a construção de microcarriers oferece maior flexibilidade e biocompatibilidade. Um bocal independente permite que uma ampla gama de bicos leves, incluindo micropipettos de vidro, sejam usados nestes sistemas de impressão. O processamento altamente controlável p…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural de Pequim (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) e o Projeto 111 (B17026).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Gelatin | SIGMA | G1890 | |
Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
Puller | sutter instrument | P-1000 | |
Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |