En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

Summary

Den gliom stamceller (GSCs) er en lille brøkdel af kræftceller, der spiller væsentlige roller i tumor indledning, angiogenese, og resistens i glioblastom (GBM), den mest udbredte og ødelæggende primære hjernesvulst. Tilstedeværelsen af GSCs gør GBM meget ildfast til de fleste af de enkelte målrettede agenter, så high-throughput screening metoder er nødvendige for at identificere potentielle effektive kombination therapeutics. Protokollen beskriver en simpel arbejdsgang for at muliggøre hurtig screening for potentiel kombinationsbehandling med synergistisk interaktion. De generelle trin i denne arbejdsgang består i at etablere luciferase-taggede GSC'er, forberede matrigelbelagte plader, kombinationslægemiddelscreening, analyse og validering af resultaterne.

Abstract

Den gliom stamceller (GSCs) er en lille brøkdel af kræftceller, der spiller væsentlige roller i tumor indledning, angiogenese, og resistens i glioblastom (GBM), den mest udbredte og ødelæggende primære hjernesvulst. Tilstedeværelsen af GSCs gør GBM meget ildfast til de fleste af de enkelte målrettede agenter, så high-throughput screening metoder er nødvendige for at identificere potentielle effektive kombination therapeutics. Protokollen beskriver en simpel arbejdsgang for at muliggøre hurtig screening for potentiel kombinationsbehandling med synergistisk interaktion. De generelle trin i denne arbejdsgang består i at etablere luciferase-taggede GSC'er, forberede matrigelbelagte plader, kombinationslægemiddelscreening, analyse og validering af resultaterne.

Introduction

Glioblastoma (GBM) er den mest almindelige og aggressive type primær hjernesvulst. I øjeblikket er den samlede overlevelse for GBM-patienter, der fik maksimal behandling (en kombination af kirurgi, kemoterapi og strålebehandling) stadig kortere end 15 måneder; så nye og effektive behandlinger for GBM er presserende behov.

Tilstedeværelsen af glioom stamceller (GSC' er) i GBM udgør en betydelig udfordring for den konventionelle behandling, da disse stamceller spiller afgørende roller i vedligeholdelsen af tumormikromiljø, lægemiddelresistens og tumorrecidiv¹. Derfor kan målretning af GSC'er være en lovende strategi for GBM-behandling². Ikke desto mindre, en stor ulempe for lægemidlets effektivitet i GBM er dens heterogenetiske karakter, herunder men ikke begrænset til forskellen i genetiske mutationer, blandede undertyper, epigenetisk regulering, og tumor mikromiljø, som gør dem meget ildfast til behandling. Efter mange mislykkede kliniske forsøg indså forskere og kliniske forskere, at målrettet behandling med et enkelt middel sandsynligvis ikke er i stand til fuldt ud at kontrollere udviklingen af meget heterogene kræftformer som GBM. Mens omhyggeligt udvalgte lægemiddelkombinationer er blevet godkendt for deres effektivitet ved synergistisk at øge effekten af hinanden og dermed give en lovende løsning til GBM-behandling.

Selv om der er mange måder at evaluere narkotika-drug interaktioner af et lægemiddel kombination, såsom CI (Combination Index), HSA (Højeste Enkelt Agent), og Bliss værdier, etc.^3,4, disse beregningsmetoder er normalt baseret på flere koncentration kombinationer. Faktisk kan disse metoder give bekræftende vurdering af interaktion mellem narkotika og narkotika, men kan være meget besværlige, hvis de anvendes i screening med høj overførselshastighed. For at forenkle processen blev der udviklet en screeningsarbejdsproces til hurtigt at identificere de potentielle lægemiddelkombinationer, der hæmmer væksten af GSC'er, der stammer fra kirurgiske biopsier af patient GBM. Et følsomhedsindeks (SI), der afspejler forskellen mellem den forventede kombinerede effekt, og den observerede kombinerede effekt blev indført i denne metode for at kvantificere den synergigivende virkning af hvert lægemiddel, så de potentielle kandidater let kan identificeres ved SI-ranglisten. I mellemtiden, denne protokol viser et eksempel skærm til at identificere de potentielle kandidater (r), der kan synergize anti-gliom effekt med temozolomide, den første linje kemoterapi for GBM behandling, blandt 20 små molekylære hæmmere.

Protocol

GBM prøve blev erhvervet fra en patient under en rutinemæssig operation efter at have indhentet fuldt informeret samtykke fra human forskning etiske udvalg af The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University.

1. Isolation og kultur af patientafledte GSC'er

1. Placer frisk kirurgisk resected glioblastoma væv i en 15 mL centrifuge rør fyldt med steril PBS og gemme vævet på isen indtil videre operation.
2. Hakke GBM væv i ca 0,5 til 1 mm diameter stykker ved hjælp af dissektion saks og vaske vævsprøver med neuronal basal medium til at fjerne cellulære vragrester i en biosikkerhed kabinet.
3. Vævsfragmenterne fordøjes med 1 mg/mL kollagen A ved 37 °C i 30 min og centrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C.
4. Fjern supernatanten og ophæng pelleten med blankt neuronalt basalt medium og fjern pellet mekanisk ved gentagne pipetter på is.
5. Kultur blandingen i ultra-lav vedhæftet fil 6-brønd kultur plader fyldt med GSC kultur medium (se tabel 1 for opskriften) i en steril celle inkubator med 5% CO₂ og 90% fugtighed ved 37 °C indtil neurosfæredannelse.
6. Ved tilstrækkelig neurosfæredannelse opsamles de ved hjælp af en pipette i en 1,5 mL mikrotube og centrifuge ved 800 x g i 5 min ved stuetemperatur.
7. Resuspend pellet og opdele det i flere kolber fyldt med ovenstående kultur medium for at opretholde de primære GSC'er.
   BEMÆRK: Patientafledte GSCs, der anvendes i eksemplet, stammer fra kirurgiske biopsier af en 34-årig mandlig patient med WHO-grad IV tilbagevendende GBM. GSCs blev navngivet som XG387 for de fremtidige eksperimenter. PCR-baserede mycoplasma tests blev udført for ovennævnte GSC'er for at bekræfte, at der ikke er nogen mycoplasma-forurening til stede. Alle de forsøg, der involverer GSCs anvendes i denne protokol blev udført <15 passager.

2. Forberedelse af luciferase-taggede GSC'er

1. SPC'erne opsamles fra den mellemstore kultur, og centrifuger dem ved 70 x g i 3 min ved stuetemperatur.
2. Fjern supernatanten, fordøje cellerne med accutase i 4 min ved 37 °C. Brug en 200 μL spids og pipette gentagne gange til at adskille og genbruge celle pellet.
3. Fortynd cellerne til 2 x 10⁵ celler pr. brønd i en 12-brønds kulturplade og kultur cellerne natten over.
4. Der tilsættes 30 μL luciferase-EGFP-virus supernatant (titer >10⁸ TU /mL) i hver brønd i pladen, og centrifuge cellerne ved 1.000 x g i 2 timer ved 25 °C. Kultur cellerne natten over.
5. Opdater mediet den næste dag og kultur cellerne for en anden 48 timer.
6. Overhold cellerne under et florescerende mikroskop for at bekræfte udseendet af GFP-positive celler.
7. Brug en flowcellesortering til at sortere og vælge GSCs med høj GFP fluorescens til kultur cellerne yderligere.

3. Bio-luminescensbaseret måling af celleens levedygtighed

1. Belægningsplader med ekstracellulær matrixblanding (ECM) (f.eks. Matrigel): Der tilsættes 40 μL 0,15 mg/mL ECM-blanding til hver brønd og inkuberes pladen i 1 time ved 37 °C. Fjern den overskydende ECM-blanding, og skyl forsigtigt en gang med PBS.
2. Tilsæt 100 μL kulturmedium, der indeholder 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 og 500 XG387-Luc celler sammen med 100 μL blank medium som kontrol i hver brønd for 6 replikerer i en 96-brønd optisk bundplade og kultur cellerne natten over ved 37 °C.
3. Fjern supernatanten, tilsæt 50 μL kulturmedium, der indeholder 150 ng/μL D-luciferin, i hver brønd, og inkuber cellerne i 5 min ved 37 °C.
4. Tag billeder af den cellulære bio-luminescens i pladen ved hjælp af IVIS spektrumbilleddannelsessystem. Brug den indbyggede software til at skabe flere cirkulære områder af interesseområdet (ROI) og kvantificere den cellulære bio-luminescens.

4. Temozolomidbehandling og kombinationsscreening

1. Precoat fire 96-brønd plader som beskrevet ovenfor, før behandlingen.
2. Frø XG387-Luc celler ved en massefylde på 1.000 celler i 100 μL kulturmedium i hver brønd af en 96-godt optisk bundplade og kultur cellerne natten over.
3. Forbered temozolomid og de målrettede midler fra lageropløsningen på forhånd. Der forberedes en koncentrationsserie bestående af 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM og 50 μM temozolomid i kulturmedium til enkeltagentbehandlingen. Fortyndet temozolomid og de målrettede stoffer i lageropløsningen i henholdsvis kulturmediet for at opnå endelige koncentrationer på 200 μM og 2 μM til screening af kombinationslægemidler (tabel 2).
4. Fjern kulturmediet, når de fleste GSC'er klæber til bunden af pladerne; tilsættes det ovenfor forberedte medium, der indeholder temozolomid, i hver brønd for tre tekniske kopier pr. behandling.
5. For at behandle Temozolomid og til at screene lægemiddelkombinationerne skal du fjerne det tomme medium og tilføje det overforberedte medium, der indeholder enten 200 μM temozolomid eller 2 μM målrettet middel, eller en kombination af begge i hver brønd for tre tekniske replikater pr. behandling.
6. Inkuber alle plader ved 37 °C, 5% CO2 i 3 dage.
7. Fjern det stofholdige medium, tilsæt 50 μL blankt medium indeholdende 150 ng/μL D-luciferin i hver brønd og inkuber cellerne i 5 min ved 37 °C.
8. Tag billeder af den cellulære bio-luminescens i pladen ved hjælp af IVIS spektrumbilleddannelsessystem. Brug den indbyggede software til at oprette flere cirkulære INVESTERINGSAFKAST og kvantificere den cellulære bio-luminescens.

5. Kombinationsbehandling af temozolomid og UMI-77 i cellelinjer XG387-Luc og XG328-Luc

1. Precoat tre 96-brønd plader som beskrevet ovenfor, før behandlingen.
2. Frø XG387-Luc og XG328-Luc celler ved en densitet på henholdsvis 1.000 celler i 100 μL kulturmedium i hver brønd af en 96-brønd optisk bundplade og kultur cellerne natten over.
3. Der forberedes en koncentrationsserie bestående af 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM og 0 μM temozolomid og en koncentrationsserie bestående af 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM og 0 μM UMI-77 i kulturmediet til seks gange seks dosis titreringsmatrixbehandlinger.
4. Fjern det tomme medium, når de fleste GSC'er klæber til bunden af pladen; tilsættes ovennævnte medium i hver brønd for tre tekniske kopier pr. behandling.
5. Inkuberes disse plader i 3 dage ved 37 °C, 5% CO₂.
6. Fjern det stofholdige medium; der tilsættes 50 μL blankt medium, der indeholder 150 ng/μL D-luciferin, i hver brønd og inkuberes cellerne i 5 min ved 37 °C til måling af bioluminescens.

6. Dataanalyse

1. Se følsomhedsindekset (SI) for temozolomid og målrettet middel i henhold til formlen i figur 2A.
   BEMÆRK: SI-scoren er at kvantificere indflydelsen af tilsætning af et andet lægemiddel. Det varierede fra -1 til +1, med positive værdier, der angiver temozolomid synergistiske virkninger.
2. Beregn kombinationsindeksværdierne (CI) mellem temozolomid og UMI-77 ved hjælp af CompuSyn-software til at analysere deres kombinerede interaktioner. CI-værdi <1 indikerer synergi; CI-værdi >1 indikerer antagonisme.
3. Beregn de høje værdier for enkeltagent (HSA) mellem temozolomid og UMI-77 ved hjælp af Combenefit-software. HSA-værdi angiver den kombinerede hæmmende effekt. HSA-værdi >0 indikerer synergi, og HSA-værdien <0 indikerer antagonisme.

Representative Results

XG387-cellerne dannede neurosfærer i det kulturmedium, der er beskrevet i tabel 1, i en ultralav fastgørelsesplade med 6 brøndskultur eller en ikke-belagt plade⁵ (Figur 1A). For det første blev der udført en test for at kontrollere, om bio-luminescensintensiteten fra XG387-Luc-cellerne var proportional med cellenummeret. Som vist i figur 1Bsteg bio-luminescensintensiteten proportionalt med celletætheden og resulterede i en lineær korrektion mellem dem (Pearson r = 0,9872; p < 0,0001; Figur 1C. Da bio-luminescensen af luciferasemærkede celler er let og hurtig at måle, giver dette en enkel metode til at måle tætheden af levedygtige GSC'er. Dernæst blev temozolomidernes anti-proliferative aktivitet vurderet. Som vist i figur 1Dforårsagede 400 μM temozolomid ca. 20% spredningshæmning af XG387-Luc-celler, hvilket tyder på, at det er nyttigt, men dets anti-GBM-effekt kan forbedres yderligere. Koncentrationen af 200 μM blev udvalgt til kombinationsscreeningen.

For at give et eksempel blev 20 mål-selektive småmolekylehæmmere brugt til lægemiddelkombinationsscreeningen for at identificere de potentielle kandidater, der forbedrer anti-GBM-effekten af temozolomid. Som følge heraf var de følsomme indeksværdier (SI) på 13 målrettede agenter over 0, og 5 af dem var over 0,1 (figur 2B, C). Især si af de to bedste kandidat narkotika UMI-77 og A 83-01 var højere end 0,25, hvilket tyder på deres potentiale til at synergisere med temozolomid.

For at validere ovenstående fund blev de klassiske synergimodeller af HSA og Bliss^3,4,6 anvendt til at bestemme den kombinerede effekt af temozolomid og UMI-77 i GSCs. Derudover blev XG328-en anden patientafledt GSC-model, der blev etableret tidligt, brugt til at udføre den samme evaluering. Anti-proliferativ analyse af den kombinerede behandling af temozolomid og UMI-77 blev udført i en seks gange seks dosis titrering matrix. Resultaterne blev analyseret for at erhverve HSA- og Bliss-værdierne, som er udlæsninger for synergistisk hæmning og skildrer forskellen mellem den forventede hæmning og den observerede hæmning. Som vist i figur 3B-Dtyder kombinationsindeksværdierne (CI) <1 og de høje værdier for enkeltagent (HSA) >0 for de fleste kombinationer af temozolomid og UMI-77 ved forskellige koncentrationer på en samlet synergistisk interaktion mellem temozolomid og UMI-77 i både XG387 og XG328 GSCs.

Figur 1: GBM patientafledte GSCs XG387. (A) Neurosfæredannelse. (B) Bio-luminescens generation af luciferase mærkede GSCs. (C) Bio-luminescens genereret af XG387-Luc celler var proportional med celletæthed. (D) Temozolomidbehandling af XG387. Hver behandling blev udført i tredoliceret med to uafhængige eksperimenter. Dataene udtrykkes som middel ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Lægemiddelkombinationsscreening ved hjælp af GSC'er. (A) Formlen til beregning af SI (følsomhedsindeks) på 20 målrettede stoffer med temozolomid (TMZ) i kombinationsskærmen. (B) Fordelingen af SI-værdier på 20 målrettede agenser. Røde prikker: de fem bedste kandidat narkotika. (C) Oplysninger om de fem bedste kandidater målrettet agenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Kombinationsbehandling af temozolomid (TMZ) og UMI-77 i XG387-Luc- og XG328-Luc-cellelinjer. (A)Enkelt- og kombinatorisk titrering af temozolomid og UMI-77 i en spredningsanalyse i XG387-Luc- og XG328-Luc-cellelinjer. (B) Isobologram og kombinationsindeksanalyse af spredningshæmningen i XG387-Luc- og XG328-Luc-celler behandlet med temozolomid og UMI-77. CI <1 angiver en synergistisk effekt. (C,D) Synergiområder genereret af Combenefit, der viser samspillet mellem temozolomid og UMI-77. Analyse af interaktion resulterede i HSA (høj enkelt agent) værdier og Bliss værdier, der angiver synergistisk effekt som beregnet ud fra den forventede. HSA- og Bliss-værdier >0 indikerer synergieffekter. Hver behandling blev udført i tredoliceret med to uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne undersøgelse blev der beskrevet en protokol, der kan anvendes til at identificere potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte GSC'er. I modsætning til standard synergi / additivity metriske model såsom Loewe, BLISS, eller HSA metoder, en enkel og hurtig arbejdsgang blev brugt, der ikke kræver et lægemiddel par, der skal kombineres ved flere koncentrationer i en fuld factorial måde som de traditionelle metoder. I denne arbejdsgang blev SI (følsomhedsindeks), som stammer fra en undersøgelse for at evaluere siRNA'ernes sensibiliserende virkning i kombination med lille molekylær hæmmer, introduceret for at kvantificere den synergistiske lægemiddeleffekt af to små molekylære hæmmere⁷. Rækken af SI-værdier er fra -1 til 1, og den positive SI-værdi indikerer en sensibiliserende effekt mellem hvert af stofferne. Jo højere SI-værdien opnåede, jo stærkere var synergien. Selv om SI-værdien alene er ude af stand til at give et bekræftende svar om typen (synergistisk, additiv eller antagonistisk) af lægemiddel-lægemiddelinteraktion, har disse toprangerede kandidater stor sandsynlighed for at synergisere med det pågældende lægemiddel og er derfor værdige til yderligere validering. Til sammenligning er de fleste af de nuværende avancerede lægemiddelkombinationsmetoder stadig besværlige og involverer vanskelige algoritmer^8,9.

For at eksemplificere gennemførligheden af denne metode blev der udført en lille testskærm. Som følge heraf var det muligt at identificere UMI-77, en selektiv MCL1-hæmmer, som den øverste kandidat blandt 20 målrettede agenter til at synergize med temozolomid i GSCs vækstundertrykkelse. Faktisk, i en tidligere undersøgelse, UMI-77 blev også fundet at synergistisk forbedre anti-gliom aktivitet temozolomid i etablerede GBM celler¹⁰. I den aktuelle undersøgelse blev det synergistiske samspil mellem UMI-77 og temozolomid godkendt igen i GSCs ved hjælp af det klassiske Chou-Talalay kombinationsindeks, BLISS eller HSA-metoder. En anden fordel ved denne protokol er brugen af luciferase-tagged GSCs til måling af den levedygtige andel af celler. Luciferase aktivitet af celler kan let måles ved tilsætning af luciferin, substratet af luciferase, og fange luminescens af ethvert instrument med funktionen af lysende måling. Fordi luciferase-luciferin reaktionen er hurtig, heri giver det en billig og hurtig løsning i forhold til traditionelle MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymoxyethphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H tetrazolium) eller CCK-8 (celletælling kit-8) assays, som alle kræver lange inkubationstider. Sammen, protokollen præsenterer en high-throughput screening af potentielle lægemiddelkombination for GBM. Protokollen giver også valgfri hurtig og enkel løsning til lægemiddelkombinationsskærm ud over standardsynergievalueringsmetoderne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.