جيل من نموذج مبسط ثلاثي الأبعاد للبشرة على رقاقة في منصة Micromachined Microfluidic
Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد نموذج بشرة مبسط وغير متمايز ثلاثي الأبعاد باستخدام منصة ميكروفلويدية ميكروماشينيد. يسمح نهج التدفق الموازي بترسب المقصورة الجلدية في الموقع لزرع الخلايا الظهارية في الأعلى ، والتي تسيطر عليها جميع مضخات الحقن.
Abstract
يقدم هذا العمل منصة ميكروفلويدية جديدة وفعالة من حيث التكلفة وموثوقة مع إمكانية توليد أنسجة معقدة متعددة الطبقات. كدليل على المفهوم ، تم تصميم جلد بشري مبسط وغير متمايز يحتوي على جلد (سترومال) ومقصورة البشرة (الظهارية). ولتحقيق ذلك، تم تطوير جهاز متعدد الاستخدامات وقوي قائم على الفينيل مقسم إلى غرفتين، للتغلب على بعض العيوب الموجودة في أجهزة microfluidic القائمة على البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) للتطبيقات الطبية الحيوية، مثل استخدام معدات مكلفة ومتخصصة أو امتصاص جزيئات وبروتينات صغيرة مسعورة. وعلاوة على ذلك، تم تطوير طريقة جديدة تقوم على التدفق الموازي، مما يتيح ترسب في الموقع من كل من المقصورات الجلدية والجلدية. يتكون بناء الجلد من مصفوفة الفيبرين التي تحتوي على الخلايا الليفية الأولية البشرية و طبقة أحادية من خلايا القرنية الخالدة المصنفة في الأعلى ، والتي يتم الحفاظ عليها لاحقا في ظل ظروف الثقافة الديناميكية. هذه المنصة الجديدة microfluidic يفتح إمكانية لنموذج الأمراض الجلدية البشرية واستقراء طريقة لتوليد الأنسجة المعقدة الأخرى.
Introduction
مؤخرا، تم إحراز تقدم نحو تطوير وإنتاج نماذج الجلد البشري في المختبر لتحليل سمية مستحضرات التجميل والمنتجات الصيدلانية1. وقد تم استخدام الباحثين في الصناعات الصيدلانية والعناية بالبشرة الحيوانات، الفئران كونها الأكثر شيوعا، لاختبار منتجاتها2،3،4،5. ومع ذلك ، فإن اختبار المنتجات على الحيوانات ليس دائما تنبؤيا بالاستجابة لدى البشر ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى فشل الدواء أو الآثار الضارة في البشر وبالتالي إلى الخسائر الاقتصادية5،6. وكانت المملكة المتحدة أول بلد يحظر استخدام الحيوانات في الاختبارات التجميلية في عام 1998. في وقت لاحق، في عام 2013، حظر الاتحاد الأوروبي اختبار واستحسان مستحضرات التجميل في الحيوانات (لائحة مستحضرات التجميل في الاتحاد الأوروبي رقم 1223/2009)7.
كما يتم النظر في هذا الحظر من قبل بلدان أخرى مثل “قانون مستحضرات التجميل الإنسانية” في الولايات المتحدةالأمريكية 8. بالإضافة إلى المخاوف الأخلاقية، فإن الاختلافات التشريحية بين جلد الحيوان والبشر تجعل اختبار الحيوانات يستغرق وقتا طويلا ومكلفا وغير فعال في كثير من الأحيان. وعلاوة على ذلك، من المتوقع أن يصل حجم السوق العالمي لاختبار السموم في المختبر إلى 26.98 مليار دولار أمريكي بحلول عام 20259. ولهذه الأسباب، هناك حاجة إلى تطوير أساليب وبدائل جديدة لأولئك الذين في المختبر الدراسات، مثل نماذج الجلد البشري المهندسة بيولوجيا، التي تمكن من اختبار السلامة والآثار السامة لمستحضرات التجميل والأدوية دون استخدام الحيوانات.
هناك نوعان مختلفان من نماذج الجلد البشري المتاحة تجاريا، في المختبر. يتكون النوع الأول من مكافئات البشرة الطبقية التي تحتوي على طبقات متعددة من الخلايا الكيراتينية المتمايزة التي تزرع على مواد مختلفة. وقد وافقت منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي على بعضها وجرى التحقق من صحتها من قبل (المركز الأوروبي للتحقق من صحة الطرق البديلة (ECVAM) لتآكل الجلد واختبار تهيج، مثل EpiDerm أو SkinEthic10،11،12. النوع الثاني هو مكافئات الجلد الكامل مع طبقة من الخلايا القرنية البشرية المتمايزة المصنفة على سقالة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) تحتوي على الخلايا الليفية ، مثل T-Skin و EpiDerm-FT. ومع ذلك ، يتم استزراع هذه النماذج في ظل ظروف ثابتة ، مما يجعلها غير قادرة على تمثيل الظروف الفسيولوجية البشرية بدقة.
وقد ركز الاهتمام مؤخرا على توليد نماذج الجلد 3D في المختبر في الخلية الثقافة إدراج (CCI) الأشكال مع التشوه الديناميكي13،14،15،16،17،18،19. ومع ذلك ، لا يمكن اعتبار هذه الأنظمة stricto sensu كجلد على رقائق ميكروفلويدي وفقا لتعريفها الكلاسيكي في هذا المجال. تعريف إنجبر للأعضاء على رقاقة تنص على أن الجهاز يجب أن توضع داخل القنوات microfluidic، وهو شرط أن عدد قليل فقط من الأجهزة تفي20،21. وقد وضعت الجلد على رقائق حتى الآن على غرار الظهارة بسيطة في الغالب كطبقات خلية واحدة و / أو طبقات الخلايا الجلدية مفصولة غشاء مسامية22،23. على الرغم من أن هناك بعض التقدم في نمذجة الجلد في النظم microfluidic16،24، لا يوجد حاليا أي أدب يظهر نظام الجهاز على رقاقة التي تناسب تعريف إنجر ، وقادرة على إنتاج الجلد متعدد الطبقات في الموقع ، بما في ذلك كل من المكونات الظهارية والسترومال.
في هذا العمل، يتم تقديم منصة ميكروفلويدية جديدة وفعالة من حيث التكلفة وقوية وقائمة على الفينيل لتطبيقات الجلد على رقاقة. تم إنتاج هذه المنصة عن طريق الآلات الدقيقة ، والتي توفر المزيد من البساطة في عملية التصنيع ، بالإضافة إلى زيادة المرونة والتنوع في تخطيط الجهاز ، والتغلب على بعض القيود المفروضة على PDMS25. كما تم تصميم طريقة لإدخال بناء الجلد المبسط من خلال تدفق مواز يتم التحكم فيه بمضخات الحقن. تدفق مواز يسمح اثنين من السوائل مع اللزوجة مختلفة جدا (عازلة وفيبرين ما قبل هلام في هذه الحالة) أن تكون متغلغلة من خلال قناة دون خلط مع بعضها البعض. كدليل على المفهوم ، تم إدخال بناء ديرمو البشرة يحتوي على الخلايا الليفية المضمنة في مصفوفة الفيبرين التي تحاكي الأدمة في الجهاز ، وعلى رأسها تم تحميل طبقة أحادية من الخلايا الكيراتينية لمحاكاة البشرة غير المتمايزة. يمكن تعديل ارتفاع المقصورة الجلدية عن طريق تعديل معدلات التدفق. الجدة الرئيسية لهذا العمل، مقارنة بالنماذج الموصوفة سابقا22و26و27و28و29،هي تطوير بناء ثلاثي الأبعاد داخل غرفة صغيرة عن طريق المايكروفلويديس. على الرغم من أن هذه المقالة تقدم بشرة مبسطة غير متمايزة ، فإن الهدف على المدى الطويل هو توليد وتوصيف بناء جلد متميز تماما لإثبات جدواه ووظائفه لأغراض الاختبار الدوائي والتجميلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان الدافع لتطوير هذه الطريقة هو الرغبة في نمذجة الأمراض الجلدية ودراسة آثار العلاجات الجديدة والمبتكرة في منصة عالية الإنتاجية. حتى الآن، ينتج هذا المختبر هذه مكافئات ديرمو البشرة عن طريق الصب إما يدويا أو بمساعدة تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد- هلام الفيبرين مع الخلايا الليفية ف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر بإخلاص الدكتور خافيير رودريغيز، والدكتورة ماريا لويزا لوبيز، وكارلوس ماتيلان، وخوان فرانسيسكو رودريغيز على اقتراحاتهم ومناقشاتهم و/أو بياناتهم الأولية المفيدة للغاية. كما نشكر مساهمات سيرجيو فيرنانديز وبيدرو هيريروس ولارا ستولزنبورغ في هذا المشروع. 11 – أتوجه بالشكر الخاص إلى الدكتورة مارتا غارسيا على المركبات الهيدروفلورية ومركبات الكربون الهيدروفلورية التي تحمل علامة GFP ومركبات الكربون الهيدروفلورية. وأخيرا، نعترف بالمساعدة التقنية الممتازة التي يقدمها غييرمو فيزكينو وأنجيليكا كورال. وقد دعم هذا العمل “برنامج العمل من قبل I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid”، مشروع S2018/BAA-4480، Biopieltec-CM. كما تم دعم هذا العمل من قبل “برنامج دي إكسلينسيا”، مشروع EPUC3M03، CAM. المجلس النيجيرى دى ايدوكاسيون اي انفيستيجاسيون
Materials
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
References
- McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
- Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).
- Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. Pronko et al. Reply. Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387 (2001).
- H.R.2858 – Humane Cosmetics Act. 114th Congress Available from: https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858 (2016)
- . Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015 Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share–trends-analysis-2014-2025-300704958.html (2018)
- Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue engineered human skin equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).
- OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).
- Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).
- vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).
- Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).
- Wu, R., et al. Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function. Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).
- Materne, E. -. M., et al. The multi-organ chip – a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).
- Schimek, K., et al. Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications. Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).
- Alberti, M., et al. Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing. Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
- Wufuer, M., et al. Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment. Scientific Reports. 6, 37471 (2016).
- Ramadana, Q., Ting, F. C. W. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).
- Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Huh, D. A human disease model of drug toxicity – induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).
- Beckwitt, C. H., et al. Liver ‘ organ on a chip ‘. Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).
- Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. Human-gut-microbiome on a chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Escámez, M. J., et al. Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement. Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).
- Llames, S. G., et al. Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin. Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).
- Llames, S., et al. Clinical results of an autologous engineered skin. Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).
- Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).
- Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip. Biomaterials. 116, 48-56 (2017).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Marx, U., et al. Human-on-a-chip’ developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man. Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation. Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- O’Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture. Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).
- Ren, K., Chen, Y., Wu, H. New materials for microfluidics in biology. Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).
