Génération d’un modèle tridimensionnel simplifié de peau sur puce dans une plate-forme microfluidique micro-usinée
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle de peau tridimensionnel simplifié et indifférencié à l’aide d’une plate-forme microfluidique micro-usinée. Une approche à flux parallèle permet le dépôt in situ d’un compartiment dermique pour l’ensemencement de cellules épithéliales sur le dessus, le tout contrôlé par des pompes à seringues.
Abstract
Ce travail présente une nouvelle plate-forme microfluidique rentable et fiable avec le potentiel de générer des tissus multicouches complexes. Comme preuve de concept, une peau humaine simplifiée et indifférenciée contenant un compartiment dermique (stromale) et un compartiment épidermique (épithélial) a été modélisée. Pour ce faire, un dispositif polyvalent et robuste à base de vinyle divisé en deux chambres a été développé, surmontant certains des inconvénients présents dans les dispositifs microfluidiques à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour des applications biomédicales, tels que l’utilisation d’équipements coûteux et spécialisés ou l’absorption de petites molécules et protéines hydrophobes. De plus, une nouvelle méthode basée sur l’écoulement parallèle a été développée, permettant le dépôt in situ des compartiments dermique et épidermique. La construction de la peau se compose d’une matrice de fibrine contenant des fibroblastes primaires humains et d’une monocouche de kératinocytes immortalisés ensemencés sur le dessus, qui est ensuite maintenue dans des conditions de culture dynamique. Cette nouvelle plateforme microfluidique ouvre la possibilité de modéliser les maladies de la peau humaine et d’extrapoler la méthode pour générer d’autres tissus complexes.
Introduction
Récemment, des progrès ont été réalisés dans le développement et la production de modèles de peau humaine in vitro pour l’analyse de la toxicité des produits cosmétiques et pharmaceutiques1. Les chercheurs des industries pharmaceutiques et des soins de la peau ont utilisé des animaux, les souris étant les plus courantes, pour tester leurs produits2,3,4,5. Cependant, tester des produits sur des animaux n’est pas toujours prédictif de la réponse chez l’homme, ce qui conduit fréquemment à une défaillance du médicament ou à des effets indésirables chez l’homme et, parconséquent,à des pertes économiques5,6. Le Royaume-Uni a été le premier pays à interdire l’utilisation d’animaux pour les tests cosmétiques en 1998. Plus tard, en 2013, l’UE a interdit les tests et l’approbation des cosmétiques chez les animaux (Règlement cosmétique de l’UE n° 1223/2009)7.
Cette interdiction est également envisagée par d’autres pays, comme dans le « Humane Cosmetics Act » aux États-Unis8. En plus des préoccupations éthiques, les différences anatomiques entre la peau animale et humaine rendent les tests sur les animaux longs, coûteux et souvent inefficaces. En outre, la taille du marché mondial des tests toxicologiques in vitro devrait atteindre 26,98 milliards USD d’ici 20259. Pour ces raisons, il est nécessaire de développer de nouvelles méthodes et alternatives pour ces études in vitro, telles que les modèles de peau humaine issus de la bioingénierie, qui permettent de tester la sécurité et les effets toxiques des cosmétiques et des médicaments sans l’utilisation d’animaux.
Il existe deux types différents de modèles de peau humaine disponibles dans le commerce, in vitro. Le premier type consiste en des équivalents épidermiques stratifiés contenant plusieurs couches de kératinocytes différenciants qui sont ensemencés sur différents matériaux. Certains d’entre eux ont été approuvés par l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) et validés par le Centre européen pour la validation des méthodes alternatives (ECVAM) pour les essais de corrosion et d’irritation de la peau, tels que EpiDerm ou SkinEthic10,11,12. Le deuxième type sont des équivalents à peau entière avec une couche de kératinocytes humains différenciants ensemencés sur un échafaudage tridimensionnel (3D) contenant des fibroblastes, tels que T-Skin et EpiDerm-FT. Cependant, ces modèles sont cultivés dans des conditions statiques, ce qui les rend incapables de représenter avec précision les conditions physiologiques humaines.
L’intérêt récent s’est concentré sur la génération de modèles de peau 3D in vitro dans des formats d’insertion de culture cellulaire (CCI) avec perfusion dynamique13,14,15,16,17,18,19. Cependant, ces systèmes ne peuvent pas être considérés comme stricto sensu comme des skin-on-chips microfluidiques selon leur définition classique dans le domaine. La définition d’Ingber pour les organes sur puce stipule que l’organe doit être placé à l’intérieur des canaux microfluidiques, ce qui est une condition que seuls quelques dispositifs remplissent20,21. Jusqu’à présent, les peaux sur puce ont modélisé principalement des épithéliums simples sous forme de couches unicellulaires et/ou de couches cellulaires dermiques séparées par une membrane poreuse22,23. Bien qu’il y ait eu quelques avancées dans la modélisation de la peau dans les systèmes microfluidiques16,24, il n’existe actuellement aucune littérature montrant un système d’organe sur puce qui correspond à la définition d’Ingber, capable de produire une peau multicouche in situ et comprenant à la fois des composants épithéliaux et stromaux.
Dans ce travail, une nouvelle plate-forme microfluidique à base de vinyle, rentable et robuste pour les applications de peau sur puce est présentée. Cette plate-forme a été produite par micro-usinage, ce qui offre plus de simplicité dans le processus de fabrication, ainsi qu’une flexibilité et une polyvalence accrues dans la disposition de l’appareil, surmontant certaines des limitations de PDMS25. Un moyen d’introduire une construction de peau simplifiée grâce à un débit parallèle contrôlé par des pompes à seringues a également été conçu. L’écoulement parallèle permet à deux fluides de viscosités très différentes (un tampon et un pré-gel de fibrine dans ce cas) d’être perfusés à travers un canal sans se mélanger l’un à l’autre. Comme preuve de concept, une construction dermo-épidermique contenant des fibroblastes incorporés dans une matrice de fibrine imitant le derme a été introduite dans le dispositif, au-dessus de laquelle une monocouche de kératinocytes a été chargée pour émuler l’épiderme indifférencié. La hauteur du compartiment dermique peut être modulée en modifiant les débits. La principale nouveauté de ce travail, par rapport aux modèles précédemment décrits22,26,27,28,29, est le développement d’une construction 3D à l’intérieur d’une microchambre au moyen de la microfluidique. Bien que cet article présente une peau simplifiée indifférenciée, l’objectif à long terme est de générer et de caractériser une construction cutanée entièrement différenciée pour démontrer sa viabilité et sa fonctionnalité à des fins de tests médicamenteux et cosmétiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La motivation pour développer cette méthode était le désir de modéliser les maladies de la peau et d’étudier les effets de thérapies nouvelles et innovantes dans une plate-forme à haut débit. À ce jour, ce laboratoire produit ces équivalents dermo-épidermiques en coulant – manuellement ou à l’aide de la technologie de bio-impression 3D – le gel de fibrine avec des fibroblastes dans une plaque d’insertion de culture cellulaire et en ensemençant les kératinocytes dessus. Une fois que les kératinocytes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions sincèrement le Dr Javier Rodríguez, le Dr María Luisa López, Carlos Matellán et Juan Francisco Rodríguez pour leurs suggestions, discussions et/ou données préliminaires très utiles. Nous remercions également les contributions de Sergio Férnandez, Pedro Herreros et Lara Stolzenburg à ce projet. Nous remercions tout particulièrement la Dre Marta García pour les hFB et les hKC étiquetés GFP. Enfin, nous reconnaissons l’excellente assistance technique de Guillermo Vizcaíno et Angélica Corral. Ce travail a été soutenu par le « Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid », Projet S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Ce travail a également été soutenu par le « Programa de excelencia », Projet EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
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