Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal vereenvoudigd en ongedifferentieerd huidmodel te genereren met behulp van een microgemachineerd microfluïdisch platform. Een parallelle stromingsbenadering maakt de in situ afzetting van een dermale compartiment mogelijk voor het zaaien van epitheelcellen bovenop, allemaal geregeld door spuitpompen.
Dit werk presenteert een nieuw, kosteneffectief en betrouwbaar microfluïdisch platform met het potentieel om complexe meerlagige weefsels te genereren. Als proof of concept is een vereenvoudigde en ongedifferentieerde menselijke huid gemodelleerd met een dermale (stromale) en een epidermale (epitheliale) compartiment. Om dit te bereiken, is een veelzijdig en robuust, op vinyl gebaseerd apparaat ontwikkeld, verdeeld in twee kamers, waarbij enkele van de nadelen van microfluïdische apparaten op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) voor biomedische toepassingen, zoals het gebruik van dure en gespecialiseerde apparatuur of de absorptie van kleine, hydrofobe moleculen en eiwitten, worden overwonnen. Bovendien werd een nieuwe methode ontwikkeld op basis van parallelle stroming, die de in situ depositie van zowel de huid- als epidermale compartimenten mogelijk maakt. Het huidconstruct bestaat uit een fibrinematrix met menselijke primaire fibroblasten en een monolaag van onsterfelijke keratinocyten die bovenop zijn gezaaid, die vervolgens wordt onderhouden onder dynamische kweekomstandigheden. Dit nieuwe microfluïdische platform opent de mogelijkheid om menselijke huidziekten te modelleren en de methode te extrapoleren om andere complexe weefsels te genereren.
Onlangs is vooruitgang geboekt in de richting van de ontwikkeling en productie van in vitro menselijke huidmodellen voor de analyse van de toxiciteit van cosmetische en farmaceutische producten1. Onderzoekers in de farmaceutische en huidverzorgingsindustrie hebben dieren gebruikt, muizen zijn de meest voorkomende, om hun producten te testen2,3,4,5. Het testen van producten op dieren is echter niet altijd voorspellend voor de respons bij mensen, wat vaak leidt tot falen van geneesmiddelen of nadelige effecten bij mensen en bijgevolg tot economische verliezen5,6. Het Verenigd Koninkrijk was in 1998 het eerste land dat het gebruik van dieren voor cosmetische tests verbood. Later, in 2013, verbood de EU het testen en toe-laten van cosmetica bij dieren (EU Cosmetics Regulation No. 1223/2009)7.
Dit verbod wordt ook door andere landen overwogen, zoals in ‘The Humane Cosmetics Act’ in de VS8. Naast ethische overwegingen maken de anatomische verschillen tussen dierlijke en menselijke huid dierproeven tijdrovend, duur en vaak ineffectief. Bovendien wordt verwacht dat de wereldwijde markt voor in vitro toxicologietests tegen 2025 USD 26,98 miljard zal bereiken9. Om deze redenen is het nodig om nieuwe methoden en alternatieven te ontwikkelen voor die in vitro studies, zoals bio-technische menselijke huidmodellen, die het testen op veiligheid en toxische effecten van cosmetica en geneesmiddelen mogelijk maken zonder het gebruik van dieren.
Er zijn twee verschillende soorten commercieel verkrijgbare, in vitro, menselijke huidmodellen. Het eerste type bestaat uit gestratificeerde epidermale equivalenten die meerdere lagen differentiërende keratinocyten bevatten die op verschillende materialen zijn gezaaid. Sommigen van hen zijn goedgekeurd door de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO) en gevalideerd door het (European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) voor huidcorrosie- en irritatietests, zoals EpiDerm of SkinEthic10,11,12. Het tweede type zijn volledige huidequivalenten met een laag differentiërende menselijke keratinocyten gezaaid op een driedimensionale (3D) steiger die fibroblasten bevat, zoals T-Skin en EpiDerm-FT. Deze modellen worden echter gekweekt onder statische omstandigheden, waardoor ze niet in staat zijn om de menselijke fysiologische omstandigheden nauwkeurig weer te geven.
Recente interesse heeft zich gericht op het genereren van in vitro 3D-huidmodellen in celkweek-insert (CCI) formaten met dynamische perfusie13,14,15,16,17,18,19. Deze systemen kunnen echter niet worden beschouwd als stricto sensu als microfluïdische skin-on-chips volgens hun klassieke definitie in het veld. Ingber’s definitie voor organen-op-een-chip stelt dat het orgaan in de microfluïdische kanalen moet worden geplaatst, wat een voorwaarde is dat slechts enkele apparaten voldoen aan20,21. Skin-on-chips hebben tot nu toe meestal eenvoudige epithelia gemodelleerd als eencellige lagen en / of dermale cellagen gescheiden door een poreusmembraan 22,23. Hoewel er enige vooruitgang is geboekt bij het modelleren van huid in microfluïdische systemen16,24, is er momenteel geen literatuur die een orgaan-op-een-chip-systeem laat zien dat voldoet aan de definitie van Ingber, in staat om een meerlagige huid in situ te produceren en zowel epitheliale als stromale componenten te bevatten.
In dit werk wordt een nieuw, kosteneffectief, robuust, op vinyl gebaseerd microfluïdisch platform voor skin-on-a-chip-toepassingen gepresenteerd. Dit platform werd geproduceerd door microbewerking, wat meer eenvoud in het fabricageproces biedt, evenals meer flexibiliteit en veelzijdigheid in de lay-out van het apparaat, waardoor enkele van de beperkingen van PDMS25worden overwonnen . Er werd ook een manier ontworpen om een vereenvoudigde huidconstructie te introduceren door middel van een parallelle stroom die wordt geregeld met spuitpompen. Parallelle stroming maakt het mogelijk om twee vloeistoffen met zeer verschillende viscositeiten (een buffer en fibrine pre-gel in dit geval) door een kanaal te laten doordringen zonder met elkaar te mengen. Als proof of concept werd een dermo-epidermaal construct met fibroblasten ingebed in een fibrinematrix die de dermis nabootst in het apparaat geïntroduceerd, waarop een monolaag van keratinocyten werd geladen om de ongedifferentieerde epidermis na te bootsen. De hoogte van het dermale compartiment kan worden gemoduleerd door de stroomsnelheden aan te passen. De belangrijkste nieuwigheid van dit werk, vergeleken met eerder beschreven modellen22,26,27,28,29,is de ontwikkeling van een 3D-constructie in een microkamer door middel van microfluïdica. Hoewel dit artikel een vereenvoudigde ongedifferentieerde huid presenteert, is het langetermijndoel om een volledig gedifferentieerd huidconstruct te genereren en te karakteriseren om de levensvatbaarheid en functionaliteit ervan voor medicijn- en cosmetische testdoeleinden aan te tonen.
De motivatie om deze methode te ontwikkelen was de wens om huidziekten te modelleren en de effecten van nieuwe en innovatieve therapieën te bestuderen in een high-throughput platform. Tot op heden produceert dit laboratorium deze dermo-epidermale equivalenten door handmatig of met behulp van de 3D-bioprinttechnologie de fibrinegel met fibroblasten in een celkweekinbrengplaat te gieten en de keratinocyten er bovenop te zaaien. Zodra de keratinocyten samenvloeiing bereiken, wordt de 3D-cultuur blootgesteld aan de lucht-vl…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán en Juan Francisco Rodríguez oprecht voor zeer nuttige suggesties, discussies en/of voorlopige gegevens. We bedanken ook de bijdragen van Sergio Férnandez, Pedro Herreros en Lara Stolzenburg aan dit project. Speciale dank gaat uit naar Dr. Marta García voor GFP-gelabelde hFBs en hKCs. Tot slot erkennen we de uitstekende technische assistentie van Guillermo Vizcaíno en Angélica Corral. Dit werk werd ondersteund door het “Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid”, Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Dit werk werd ook ondersteund door het “Programa de excelencia”, Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
Culture plates | Fisher | ||
DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
Glass slide | Thermo Scientific | ||
GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
Live/dead kit | Invitrogen | ||
PBS | Sigma Aldrich | ||
Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
Syringes | Terumo | 5 mL | |
Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |