Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force
Summary
Présenté ici est un protocole complet pour effectuer des expériences de serrage de force ultrarapide sur des moteurs de myosine-5 processive, qui pourrait être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs. Le protocole détaille toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par l’acquisition et l’analyse des données.
Abstract
La spectroscopie ultrarapide de pince de force (UFFCS) est une technique à molécule unique basée sur des pinces laser qui permet d’étudier la chimiomécanique des myosines conventionnelles et non conventionnelles sous charge avec une résolution temporelle sans précédent. En particulier, la possibilité de sonder les moteurs de myosine sous force constante juste après la formation de la liaison actine-myosine, ainsi que le taux élevé de retour de force (200 kHz), ont montré que l’UFFCS est un outil précieux pour étudier la dépendance de charge de dynamiques rapides telles que la course de travail de la myosine. De plus, UFFCS permet d’étudier comment les interactions processives et non processives myosine-actine sont influencées par l’intensité et la direction de la force appliquée.
En suivant ce protocole, il sera possible d’effectuer des expériences de serrage de force ultrarapides sur des moteurs de myosine-5 processive et sur une variété de myosines non conventionnelles. Par quelques ajustements, le protocole pourrait également être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs tels que les kinésines et les dynéines. Le protocole comprend toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par les procédures d’étalonnage, l’acquisition et l’analyse des données.
Introduction
Au cours des dernières décennies, les pinces optiques ont été un outil précieux pour élucider la mécanochimie des interactions protéiques au niveau de la molécule unique, en raison de la possibilité frappante de manipulation et de mesure simultanées des changements conformationnels et de la cinétique enzymatique 1,2. En particulier, la capacité d’appliquer et de mesurer des forces dans la gamme de celles exercées par les moteurs moléculaires dans la cellule, ainsi que la capacité de mesurer les changements conformationnels subnanométriques, ont fait des pincettes optiques un outil unique à molécule unique pour démêler les propriétés chimiomécaniques des protéines motrices et leur régulation mécanique.
La spectroscopie ultrarapide de serrage de force (UFFCS) est une technique de spectroscopie de force à molécule unique basée sur des pinces optiques, développée pour étudier la cinétique rapide des moteurs moléculaires sous charge dans une géométrie à trois billes (Figure 1a)3,4. L’UFFCS réduit le délai d’application de la force à la protéine motrice à la limite physique des pincettes optiques, c’est-à-dire le temps de relaxation mécanique du système, permettant ainsi l’application de la force rapidement après le début d’une poussée de myosine (quelques dizaines de microsecondes)3. Cette capacité a été exploitée pour étudier les premiers événements mécaniques de la myosine musculaire rapide squelettique 3 et cardiaque5 afin de révéler la dépendance de charge du coup de puissance, les états de liaison faible et forte, ainsi que l’ordre des événements biochimiques (Pi) et mécaniques (coup de puissance).
La géométrie à trois billes est généralement utilisée pour étudier les moteurs non processifs, une géométrie à une seule bille avec une pince de force a été couramment utilisée pour étudier les myosines non conventionnelles processives telles que la myosine Va6. Cependant, il y a plusieurs raisons de préférer un test UFFCS à trois billes également pour les myosines processives. Tout d’abord, l’application rapide de la charge juste après la liaison actine-myosine permet de mesurer les événements précoces dans le développement de la force comme dans les moteurs non processifs. En outre, dans le cas des moteurs processifs, il permet également une mesure précise des longueurs de course du moteur et de leurs durées de fonctionnement à force constante tout au long de leur progression (Figure 1b). De plus, en raison du taux élevé de retour de force, le système peut maintenir la force constante lors de changements rapides de position, tels que la course de travail de myosine, garantissant ainsi une charge constante pendant le pas moteur. La résolution temporelle élevée du système permet la détection des interactions sub-ms, ouvrant la possibilité d’étudier la faible liaison de la myosine à l’actine. Enfin, la géométrie du dosage garantit que la force est appliquée le long du filament d’actine, avec des composantes transversales et verticales négligeables de la force. Ce point est d’autant plus important que la composante de force verticale influence de manière significative la dépendance à la charge de la cinétique du moteur 7,8. En utilisant cette technique, nous avons pu appliquer une gamme de charges assistives et résistives à la myosine-5B processive et mesurer directement la dépendance de charge de sa processivité pour une large gamme de forces4.
Comme le montre la figure 1a, dans ce système, un seul filament d’actine est suspendu entre deux billes de polystyrène piégées dans le foyer d’une pince optique double (l’« haltère »). Une force nette déséquilibrée F= F1-F 2 est imposée au filament, grâce à un système de rétroaction rapide, qui fait que le filament se déplace à vitesse constante dans une direction jusqu’à ce qu’il atteigne un point d’inversion défini par l’utilisateur où la force nette est inversée dans la direction opposée. Lorsque la protéine motrice n’interagit pas avec le filament, l’haltère est libre de se déplacer d’avant en arrière en forme d’onde triangulaire (Figure 1b, panneau inférieur) couvrant le cordon du piédestal sur lequel une seule protéine motrice est fixée. Une fois l’interaction établie, la force portée par l’haltère est très rapidement transférée à la protéine motrice et le moteur commence à déplacer le filament en passant sous l’intensité et la direction de la force appliquée par le système de rétroaction au moment de l’interaction, jusqu’à ce que la myosine se détache de l’actine. Étant le déplacement produit par le pas du moteur dépendant de la polarité du filament d’actine piégé, selon la direction de la force appliquée, la charge peut être soit assistée, c’est-à-dire poussée dans la même direction que le déplacement du moteur (poussée dans le panneau supérieur de la figure 1b), soit résistive, c’est-à-dire tirant dans la direction opposée par rapport au déplacement du moteur (traction à la figure 1b panneau supérieur) permettant d’étudier la régulation chimiomécanique de la processivité motrice tant par l’intensité que par la directionnalité de la charge appliquée.
Dans les sections suivantes, toutes les étapes pour mesurer les interactions actine-myosine-5B sous différentes charges avec une configuration de spectroscopie à pince de force ultrarapide sont entièrement décrites, y compris 1) la mise en place de la configuration optique, l’alignement des pièges optiques et les procédures d’étalonnage, 2) la préparation de tous les composants et leur assemblage dans la chambre d’échantillonnage, 3) la procédure de mesure, 4) des données représentatives et une analyse des données pour extraire des paramètres physiques importants, tels que la longueur de la course, la taille du pas et la vitesse de la protéine motrice.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les techniques à molécule unique, telles que le test à trois billes, soient techniquement difficiles et à faible débit, UFFCS améliore la détection des interactions moléculaires grâce au rapport signal sur bruit élevé des données. UFFCS permet l’étude de la dépendance à la charge des protéines motrices, avec les principaux avantages d’appliquer la force très rapidement lors de la liaison du moteur au filament pour sonder les événements précoces et très rapides dans la production de force…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n ° 871124 Laserlab-Europe, par le ministère italien de l’Université et de la Recherche (FIRB « Futuro in Ricerca » 2013 Grant No. RBFR13V4M2), et par Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk a été soutenu par la bourse interdisciplinaire LT008/2020-C du Human Frontier Science Program.
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
- Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
- Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
- Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
- Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin’s load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
- Capitanio, M. . Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
- Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
- Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
- Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
- Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
- Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).
