ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד
Summary
מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.
Abstract
ספקטרוסקופיית מהדק כוח אולטרה-מהירה (UFFCS) היא טכניקה של מולקולה בודדת המבוססת על פינצטה לייזר המאפשרת לחקור את הכימומכניקה של מיוזין קונבנציונלי ולא קונבנציונלי תחת עומס ברזולוציית זמן חסרת תקדים. בפרט, האפשרות לחקור מנועי מיוזין תחת כוח קבוע מיד לאחר היווצרות הקשר אקטין מיוזין, יחד עם השיעור הגבוה של משוב הכוח (200 קילוהרץ), הראתה UFFCS ככלי רב ערך לחקר התלות בעומס של דינמיקה מהירה כגון שבץ עבודה מיוזין. יתר על כן, UFFCS מאפשר לחקור כיצד אינטראקציות מיוזין-אקטין תהליכיות ולא תהליכיות מושפעות מהעוצמה והכיוון של הכוח המופעל.
על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן יהיה לבצע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים ועל מגוון מיוזין לא קונבנציונלי. על ידי התאמות מסוימות, ניתן להרחיב את הפרוטוקול בקלות גם לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים כגון קינזין ודינינים. הפרוטוקול כולל את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, הליכי כיול, איסוף נתונים וניתוחם.
Introduction
בעשורים האחרונים פינצטה אופטית הייתה כלי רב ערך להבהרת המכנוכימיה של אינטראקציות חלבונים ברמת המולקולה הבודדת, בשל האפשרות הבולטת של מניפולציה ומדידה בו זמנית של שינויי קונפורמציה וקינטיקה אנזימטית 1,2. בפרט, היכולת להפעיל ולמדוד כוחות בטווח של אלה המופעלים על ידי מנועים מולקולריים בתא, יחד עם היכולת למדוד שינויים קונפורמטיביים תת-ננומטריים, הפכו את הפינצטה האופטית לכלי ייחודי של מולקולה בודדת לפענוח התכונות הכימומכניות של חלבונים מוטוריים והוויסות המכני שלהם.
ספקטרוסקופיית מהדק כוח אולטרה-מהירה (UFFCS) היא טכניקת ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה יחידה המבוססת על פינצטה אופטית, שפותחה כדי לחקור את הקינטיקה המהירה של מנועים מולקולריים תחת עומס בגאומטריה של שלושה חרוזים (איור 1a)3,4. UFFCS מפחית את השהיית הזמן להפעלת הכוח על חלבון המנוע עד לגבול הפיזיקלי של פינצטה אופטית, כלומר זמן ההרפיה המכנית של המערכת, ובכך מאפשר הפעלת הכוח במהירות לאחר תחילת ריצת מיוזין (כמה עשרות מיקרו-שניות)3. יכולת זו נוצלה כדי לחקור את האירועים המכניים המוקדמים בשריר השלד המהיר 3 ושריר הלב5 כדי לחשוף את התלות בעומס של מכת הכוח, מצבי הקישור החלשים והחזקים, כמו גם את סדר האירועים הביוכימיים (Pi) והמכניים (powerstroke).
גיאומטריית שלושת החרוזים משמשת בדרך כלל לחקר מנועים לא תהליכיים, גיאומטריית חרוז יחיד עם מהדק כוח שימשה בדרך כלל לחקר מיוזין לא קונבנציונלי תהליכי, כגון מיוזין Va6. עם זאת, ישנן מספר סיבות להעדיף בדיקת UFFCS בעלת שלושה חרוזים גם עבור מיוזין תהליכי. ראשית, היישום המהיר של עומס מיד לאחר קשירת אקטין מיוזין מאפשר מדידה של האירועים המוקדמים בהתפתחות הכוח כמו במנועים שאינם תהליכים. בנוסף, במקרה של מנועים תהליכיים זה גם מאפשר מדידה מדויקת של אורכי הריצה של המנוע ומשכי הריצה שלו תחת כוח קבוע לאורך כל ההתקדמות שלהם (איור 1b). יתר על כן, בגלל הקצב הגבוה של משוב הכוח, המערכת יכולה לשמור על כוח קבוע במהלך שינויים מהירים במיקום, כגון מכת עבודה מיוזין, ובכך להבטיח עומס קבוע במהלך דריכה מוטורית. הרזולוציה הטמפורלית הגבוהה של המערכת מאפשרת זיהוי אינטראקציות תת-אלפיות שנייה, ופותחת את האפשרות לחקור קשירה חלשה של מיוזין לאקטין. לבסוף, גיאומטריית הבדיקה מבטיחה שהכוח יופעל לאורך חוט האקטין עם רכיבים רוחביים ואנכיים זניחים של הכוח. נקודה זו רלוונטית במיוחד מכיוון שרכיב הכוח האנכי הוכח כמשפיע באופן משמעותי על התלות בעומס של קינטיקה מוטורית 7,8. על ידי שימוש בטכניקה זו, אנו יכולים ליישם מגוון של עומסים מסייעים והתנגדותיים על מיוזין-5B תהליכיים ולמדוד ישירות את תלות העומס של התהליכות שלו עבור מגוון רחב של כוחות4.
כפי שניתן לראות באיור 1a, במערכת זו חוט להט אקטין יחיד תלוי בין שני חרוזי פוליסטירן הכלואים במוקד של פינצטה אופטית כפולה (“משקולת”). כוח נטו לא מאוזן F = F1-F 2 מוטל על חוט הלהט, באמצעות מערכת משוב מהירה, אשר גורמת לחוט הלהט לנוע במהירות קבועה בכיוון אחד עד שהוא מגיע לנקודת היפוך מוגדרת על ידי המשתמש שבה הכוח נטו מתהפך בכיוון ההפוך. כאשר החלבון המוטורי אינו מתקשר עם חוט הלהט, המשקולת חופשייה לנוע קדימה ואחורה בצורת גל משולש (איור 1b, לוח תחתון) המשתרע על חרוז הכן שעליו מחובר חלבון מוטורי יחיד. ברגע שהאינטראקציה נוצרת, הכוח שנישא על ידי המשקולת מועבר במהירות רבה לחלבון המוטורי והמנוע מתחיל להזיז את חוט הלהט על ידי דריכה מתחת לעוצמת הכוח והכיוון שהופעלו על ידי מערכת המשוב בזמן האינטראקציה, עד שהמיוזין מתנתק מאקטין. בהיותו התזוזה הנוצרת על ידי דריכת המנוע התלויה בקוטביות של חוט האקטין הלכוד, על פי כיוון הכוח המופעל העומס יכול להיות מסייע, כלומר דוחף באותו כיוון של תזוזת המנוע (דחיפה בלוח העליון של איור 1b), או התנגדותי, כלומר משיכה בכיוון ההפוך ביחס לתזוזה המוטורית (משיכה באיור 1b פאנל עליון) המאפשר ללמוד את הרגולציה הכימומכנית של התהליכות המוטורית הן על ידי העוצמה והן על ידי הכיווניות של העומס המופעל.
בסעיפים הבאים מתוארים במלואם כל השלבים למדידת אינטראקציות אקטין מיוזין-5B תחת עומסים שונים עם מערך ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהיר במיוחד, כולל 1) הגדרת ההתקנה האופטית, הליכי יישור וכיול מלכודות אופטיות, 2) הכנת כל הרכיבים והרכבתם בתא הדגימה, 3) הליך המדידה, 4) נתונים מייצגים וניתוח נתונים כדי לחלץ פרמטרים פיזיקליים חשובים, כגון אורך הריצה, גודל הצעד ומהירות החלבון המוטורי.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שטכניקות של מולקולות בודדות, כגון מבחן שלושת החרוזים, הן מאתגרות מבחינה טכנית ובעלות תפוקה נמוכה, UFFCS משפר את זיהוי האינטראקציות המולקולריות הודות ליחס האות לרעש הגבוה של הנתונים. UFFCS מאפשר לחקור את התלות בעומס של חלבונים מוטוריים, עם היתרונות העיקריים של הפעלת הכוח במהירות רבה עם קש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מס ‘871124 Laserlab-Europe, על ידי משרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (FIRB “Futuro in Ricerca” 2013 Grant No. RBFR13V4M2), ועל ידי Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk נתמך על ידי תוכנית מדעי החזית האנושית מלגת LT008/2020-C.
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
- Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
- Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
- Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
- Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin’s load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
- Capitanio, M. . Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
- Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
- Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
- Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
- Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
- Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).
