Рассечение механоферментных свойств процессивных миозидов с помощью сверхбыстрой силово-зажимной спектроскопии
Summary
Здесь представлен комплексный протокол для проведения сверхбыстрых экспериментов с силовым зажимом на процессивных двигателях миозина-5, который можно легко распространить на изучение других классов процессных двигателей. В протоколе подробно описаны все необходимые этапы, от настройки экспериментального аппарата до пробоподготовки, сбора и анализа данных.
Abstract
Сверхбыстрая силово-зажимная спектроскопия (UFFCS) представляет собой одномолекулярную методику, основанную на лазерном пинцете, которая позволяет исследовать хемомеханику как обычных, так и нетрадиционных миозинов под нагрузкой с беспрецедентным временным разрешением. В частности, возможность зондирования миозиновых двигателей под постоянной силой сразу после образования актин-миозиновой связи вместе с высокой скоростью силовой обратной связи (200 кГц) показала, что UFFCS является ценным инструментом для изучения зависимости нагрузки от быстрой динамики, такой как рабочий ход миозина. Кроме того, UFFCS позволяет изучать, как процессивные и непроцессные взаимодействия миозин-актин влияют на интенсивность и направление приложенной силы.
Следуя этому протоколу, можно будет проводить сверхбыстрые эксперименты с силовым зажимом на процессивных двигателях миозина-5 и на различных нетрадиционных миозинах. Путем некоторых корректировок протокол также может быть легко распространен на изучение других классов процессивных двигателей, таких как кинезины и динеины. Протокол включает в себя все необходимые этапы, от настройки экспериментального аппарата до пробоподготовки, процедур калибровки, сбора и анализа данных.
Introduction
В последние десятилетия оптический пинцет был ценным инструментом для выяснения механохимии белковых взаимодействий на уровне одной молекулы из-за поразительной возможности одновременных манипуляций и измерения конформационных изменений и ферментативной кинетики 1,2. В частности, способность применять и измерять силы в диапазоне сил, оказываемых молекулярными двигателями в клетке, вместе со способностью измерять субнанометровые конформационные изменения сделали оптический пинцет уникальным одномолекулярным инструментом для разгадки хемомеханических свойств моторных белков и их механической регуляции.
Сверхбыстрая силово-зажимная спектроскопия (UFFCS) – это метод одномолекулярной силовой спектроскопии, основанный на оптических пинцетах, разработанный для изучения быстрой кинетики молекулярных двигателей под нагрузкой в трехшаровой геометрии (рисунок 1a)3,4. UFFCS сокращает временной лаг для приложения силы к моторному белку до физического предела оптического пинцета, т. е. времени механической релаксации системы, что позволяет быстро прикладывать силу после начала пробега миозина (несколько десятков микросекунд)3. Эта способность была использована для исследования ранних механических событий в быстрых скелетных 3 и сердечных5 мышцах миозина, чтобы выявить зависимость нагрузки от силового удара, слабых и сильных связывающих состояний, а также порядок биохимических (Pi) и механических (powerstroke) событий.
Геометрия из трех шариков обычно используется для изучения непроцессных двигателей, геометрия одного шарика с силовым зажимом обычно используется для исследования процессных нетрадиционных миозинов, таких как миозин Va6. Тем не менее, есть несколько причин, чтобы предпочесть анализ UFFCS с тремя шариками также для процессивных миозинов. Во-первых, быстрое применение нагрузки сразу после связывания актин-миозин позволяет измерять ранние события в развитии силы, как в непроцессных двигателях. Кроме того, в случае процессивных двигателей это также позволяет точно измерять длину хода двигателя и продолжительность хода при постоянном усилии на протяжении всей их прогрессии (рисунок 1b). Кроме того, из-за высокой скорости силовой обратной связи система может поддерживать постоянную силу во время быстрых изменений положения, таких как рабочий ход миозина, тем самым гарантируя постоянную нагрузку во время шага двигателя. Высокое временное разрешение системы позволяет обнаруживать суб-мс взаимодействия, открывая возможность исследования слабого связывания миозина с актином. Наконец, геометрия анализа гарантирует, что сила приложена вдоль актиновой нити, с незначительными поперечными и вертикальными компонентами силы. Этот момент имеет особое значение, поскольку было показано, что вертикальная силовая составляющая существенно влияет на нагрузочную зависимость кинетики двигателя 7,8. Используя эту технику, мы могли бы применить ряд вспомогательных и резистивных нагрузок к процессивному миозину-5B и непосредственно измерить зависимость нагрузки от его процессивности для широкого диапазона сил4.
Как показано на фиг.1а, в этой системе одна актиновая нить подвешена между двумя полистирольными шариками, захваченными в фокусе двойного оптического пинцета («гантели»). Несбалансированная чистая сила F= F1-F 2 накладывается на нить через систему быстрой обратной связи, которая заставляет нить накала двигаться с постоянной скоростью в одном направлении, пока она не достигнет определенной пользователем точки инверсии, где чистая сила обращена в противоположном направлении. Когда моторный белок не взаимодействует с нитью, гантель может свободно перемещаться вперед и назад в форме треугольной волны (рисунок 1b, нижняя панель), охватывающей бусину пьедестала, на которой прикреплен один двигательный белок. Как только взаимодействие установлено, сила, переносимая гантелью, очень быстро передается моторному белку, и двигатель начинает вытеснять нить накала, наступая под интенсивность и направление силы, которые были приложены системой обратной связи во время взаимодействия, пока миозин не отделяется от актина. Поскольку смещение, создаваемое шагом двигателя, зависит от полярности захваченной актиновой нити накала, в зависимости от направления приложенной силы нагрузка может быть либо вспомогательной, т.е. толкающей в том же направлении двигатель смещения (толчок на фиг.1b верхней панели), либо резистивной, т.е. тягой в противоположном направлении по отношению к смещению двигателя (тяга на фиг.1b) верхняя панель), позволяющая изучать хемомеханическую регуляцию двигательной процессности как по интенсивности, так и по направленности приложенной нагрузки.
В следующих разделах полностью описаны все этапы измерения взаимодействий актин-миозин-5В при различных нагрузках с установкой сверхбыстрой силово-зажимной спектроскопии, в том числе 1) настройка оптической установки, выравнивание оптических ловушек и процедуры калибровки, 2) подготовка всех компонентов и их сборка в камере для образцов, 3) процедура измерения, 4) репрезентативные данные и анализ данных для извлечения важных физических параметров, таких как длина пробега, размер шага и скорость моторного белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя методы с одной молекулой, такие как трехшарновый анализ, технически сложны и имеют низкую пропускную способность, UFFCS улучшает обнаружение молекулярных взаимодействий благодаря высокому соотношению сигнал/шум данных. UFFCS позволяет изучать нагрузочно-зависимость моторных белков,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках Грантового соглашения No 871124 Laserlab-Europe, Министерством университетов и исследований Италии (грант FIRB «Futuro in Ricerca» 2013 года No RBFR13V4M2) и Ente Cassa di Risparmio di Firenze. А.В. Кащук получил поддержку междисциплинарной стипендии Human Frontier Science Program Lt008/2020-C.
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
- Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
- Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
- Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
- Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin’s load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
- Capitanio, M. . Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
- Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
- Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
- Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
- Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
- Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).
