Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida
Summary
Apresenta-se aqui um protocolo abrangente para a realização de experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores processivos de miosina-5, que poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos. O protocolo detalha todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparato experimental até a preparação da amostra, aquisição e análise dos dados.
Abstract
A espectroscopia ultrarrápida de pinça de força (UFFCS) é uma técnica de molécula única baseada em pinças a laser que permite a investigação da quimiomecânica de miosinas convencionais e não convencionais sob carga com resolução de tempo sem precedentes. Em particular, a possibilidade de sondar motores de miosina sob força constante logo após a formação da ligação actina-miosina, juntamente com a alta taxa de feedback de força (200 kHz), mostrou que a UFFCS é uma ferramenta valiosa para estudar a dependência de carga de dinâmicas rápidas, como o acidente vascular cerebral de trabalho da miosina. Além disso, a UFFCS permite o estudo de como as interações miosina-actina processivas e não processivas são influenciadas pela intensidade e direção da força aplicada.
Seguindo este protocolo, será possível realizar experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores de miosina-5 processiva e em uma variedade de miosinas não convencionais. Por alguns ajustes, o protocolo também poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos, como cinesinas e dineínas. O protocolo inclui todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparelho experimental até a preparação da amostra, procedimentos de calibração, aquisição e análise de dados.
Introduction
Nas últimas décadas, as pinças ópticas têm sido uma ferramenta valiosa para elucidar a mecanoquímica das interações proteicas no nível de molécula única, devido à impressionante possibilidade de manipulação e mensuração simultâneas de alterações conformacionais e cinética enzimática 1,2. Em particular, a capacidade de aplicar e medir forças na faixa daquelas exercidas por motores moleculares na célula, juntamente com a capacidade de medir mudanças conformacionais subnanométricas, tornou as pinças ópticas uma ferramenta única de molécula única para desvendar as propriedades quimiomecânicas das proteínas motoras e sua regulação mecânica.
A espectroscopia de pinça de força ultrarrápida (UFFCS) é uma técnica de espectroscopia de força de molécula única baseada em pinças ópticas, desenvolvida para estudar a cinética rápida de motores moleculares sob carga em uma geometria de três esferas (Figura 1a)3,4. A UFFCS reduz o intervalo de tempo para aplicação de força à proteína motora ao limite físico das pinças ópticas, ou seja, o tempo de relaxamento mecânico do sistema, permitindo assim a aplicação da força rapidamente após o início de uma corrida de miosina (poucas dezenas de microssegundos)3. Essa capacidade tem sido explorada para investigar os primeiros eventos mecânicos na miosina do músculo esquelético rápido 3 e cardíaco5 para revelar a dependência de carga do powerstroke, os estados de ligação fraca e forte, bem como a ordem dos eventos bioquímicos (Pi) e mecânicos (powerstroke).
A geometria de três esferas é geralmente empregada para estudar motores não processivos, uma geometria de um único grânulo com um grampo de força tem sido comumente usada para investigar miosinas processivas não convencionais, como a miosina Va6. No entanto, existem várias razões para preferir um ensaio UFFCS de três contas também para miosinas processivas. Em primeiro lugar, a rápida aplicação da carga logo após a ligação actina-miosina permite a medição dos eventos iniciais no desenvolvimento da força, como em motores não processivos. Além disso, no caso de motores processivos, também permite uma medição precisa dos comprimentos de funcionamento e durações de funcionamento do motor sob força constante durante toda a sua progressão (Figura 1b). Além disso, devido à alta taxa de feedback de força, o sistema pode manter a força constante durante mudanças rápidas de posição, como o curso de trabalho da miosina, garantindo assim uma carga constante durante o passo motor. A alta resolução temporal do sistema permite a detecção de interações sub-ms, abrindo a possibilidade de investigar a fraca ligação da miosina à actina. Finalmente, a geometria do ensaio garante que a força seja aplicada ao longo do filamento de actina, com componentes transversais e verticais insignificantes da força. Este ponto é de particular relevância, uma vez que o componente de força vertical demonstrou influenciar significativamente a dependência de carga da cinética do motor 7,8. Utilizando essa técnica, pudemos aplicar uma gama de cargas assistivas e resistivas à miosina-5B processiva e medir diretamente a dependência de carga de sua processividade para uma ampla gama de forças4.
Como mostrado na Figura 1a, neste sistema um único filamento de actina é suspenso entre duas esferas de poliestireno presas no foco de pinças ópticas duplas (o “haltere”). Uma força líquida desequilibrada F= F1-F 2 é imposta ao filamento, através de um sistema de feedback rápido, que faz com que o filamento se mova a uma velocidade constante em uma direção até atingir um ponto de inversão definido pelo usuário, onde a força líquida é revertida na direção oposta. Quando a proteína motora não está interagindo com o filamento, o haltere está livre para se mover para frente e para trás em uma forma de onda triangular (Figura 1b, painel inferior) abrangendo o grânulo do pedestal no qual uma única proteína motora está ligada. Uma vez que a interação é estabelecida, a força transportada pelo haltere é muito rapidamente transferida para a proteína motora e o motor começa a deslocar o filamento, pisando sob a intensidade e direção da força que foi aplicada pelo sistema de feedback no momento da interação, até que a miosina se desprenda da actina. Sendo o deslocamento produzido pelo passo do motor dependente da polaridade do filamento de actina preso, de acordo com a direção da força aplicada a carga pode ser tanto assistiva, ou seja, empurrando na mesma direção do deslocamento do motor (empurrar no painel superior da Figura 1b), ou resistiva, ou seja, puxando na direção oposta em relação ao deslocamento do motor (puxar na Figura 1b painel superior) possibilitando estudar a regulação quimiomecânica da processividade motora tanto pela intensidade quanto pela direcionalidade da carga aplicada.
Nas próximas seções, todas as etapas para medir as interações actina-miosina-5B sob diferentes cargas com uma configuração ultrarrápida de espectroscopia força-pinça são totalmente descritas, incluindo 1) a configuração da configuração óptica, alinhamento de armadilhas ópticas e procedimentos de calibração, 2) as preparações de todos os componentes e sua montagem na câmara de amostra, 3) o procedimento de medição, 4) dados representativos e análise de dados para extrair parâmetros físicos importantes, como o comprimento da corrida, o tamanho do passo e a velocidade da proteína motora.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora as técnicas de molécula única, como o ensaio de três contas, sejam tecnicamente desafiadoras e de baixo rendimento, o UFFCS melhora a detecção de interações moleculares graças à alta relação sinal-ruído dos dados. A UFFCS permite o estudo da dependência de carga de proteínas motoras, com as principais vantagens de aplicar a força muito rapidamente após a ligação do motor ao filamento para sondar eventos precoces e muito rápidos na produção de força e estados de ligação fracos sob força co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de Subvenção n.º 871124 Laserlab-Europe, pelo Ministério da Universidade e Investigação italiano (FIRB “Futuro in Ricerca” 2013 Grant No. RBFR13V4M2) e por Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk foi apoiado pela Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
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