यहां प्रस्तुत प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 मोटर्स पर अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप प्रयोगों को करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल है, जिसे आसानी से प्रक्रियात्मक मोटर्स के अन्य वर्गों के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है। प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक उपकरण के सेटअप से लेकर नमूना तैयार करने, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण तक सभी आवश्यक चरणों का विवरण देता है।
अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूएफएफसीएस) लेजर ट्वीज़र्स पर आधारित एक एकल अणु तकनीक है जो अभूतपूर्व समय संकल्प के साथ लोड के तहत पारंपरिक और अपरंपरागत मायोसिन दोनों के केमोमैकेनिक्स की जांच की अनुमति देती है। विशेष रूप से, एक्टिन-मायोसिन बॉन्ड गठन के ठीक बाद निरंतर बल के तहत मायोसिन मोटर्स की जांच करने की संभावना, बल प्रतिक्रिया (200 kHz) की उच्च दर के साथ, यूएफसी को मायोसिन वर्किंग स्ट्रोक जैसे तेज गतिशीलता की भार निर्भरता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण दिखाया गया है। इसके अलावा, यूएफएफसीएस इस अध्ययन को सक्षम बनाता है कि कैसे प्रक्रियात्मक और गैर-प्रक्रियात्मक मायोसिन-एक्टिन इंटरैक्शन लागू बल की तीव्रता और दिशा से प्रभावित होते हैं।
इस प्रोटोकॉल का पालन करके, प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 मोटर्स और विभिन्न प्रकार के अपरंपरागत मायोसिन पर अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप प्रयोग करना संभव होगा। कुछ समायोजनों द्वारा, प्रोटोकॉल को आसानी से किन्सिन और डायनिन जैसे प्रक्रियात्मक मोटर्स के अन्य वर्गों के अध्ययन के लिए भी बढ़ाया जा सकता है। प्रोटोकॉल में प्रयोगात्मक उपकरण के सेटअप से लेकर नमूना तैयार करने, अंशांकन प्रक्रियाओं, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण तक सभी आवश्यक कदम शामिल हैं।
पिछले दशकों में ऑप्टिकल चिमटी एकल अणु स्तर पर प्रोटीन इंटरैक्शन के मेकेनोकेमिस्ट्री को स्पष्ट करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण रहा है, समवर्ती हेरफेर और संवहन परिवर्तनों और एंजाइमेटिक कैनेटीक्स 1,2 के माप की हड़ताली संभावना के कारण। विशेष रूप से, सेल में आणविक मोटर्स द्वारा लगाए गए बलों की सीमा में बलों को लागू करने और मापने की क्षमता, साथ ही उप-नैनोमीटर संवहन परिवर्तनों को मापने की क्षमता ने ऑप्टिकल ट्वीज़र्स को मोटर प्रोटीन के केमोमेकैनिकल गुणों और उनके यांत्रिक विनियमन को उजागर करने के लिए एक अद्वितीय एकल-अणु उपकरण बना दिया।
अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूएफएफसीएस) ऑप्टिकल ट्वीज़र्स पर आधारित एक एकल-अणु बल-स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है, जिसे तीन-मोती ज्यामिति (चित्रा 1 ए) 3,4 में लोड के तहत आणविक मोटर्स के तेज कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। यूएफएफसीएस मोटर प्रोटीन के लिए बल आवेदन के लिए समय अंतराल को ऑप्टिकल ट्वीज़र्स की भौतिक सीमा तक कम कर देता है, यानी, सिस्टम का यांत्रिक विश्राम समय, इस प्रकार मायोसिन रन (कुछ दसियों माइक्रोसेकंड) की शुरुआत के बाद बल के आवेदन को तेजी से अनुमति देता है। इस क्षमता का उपयोग तेजी से कंकाल 3 और कार्डियक5 मांसपेशी मायोसिन में प्रारंभिक यांत्रिक घटनाओं की जांच करने के लिए किया गया है ताकि पावरस्ट्रोक, कमजोर और मजबूत-बाध्यकारी अवस्थाओं की भार निर्भरता को प्रकट किया जा सके, साथ ही जैव रासायनिक (पीआई) और यांत्रिक (पावरस्ट्रोक) घटनाओं का क्रम भी प्रकट किया जा सके।
तीन-मोती ज्यामिति को आमतौर पर गैर-प्रक्रियात्मक मोटर्स का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जाता है, बल-क्लैंप के साथ एक एकल मोती ज्यामिति का उपयोग आमतौर पर मायोसिन वीए 6 जैसे प्रक्रियात्मक गैर-पारंपरिक मायोसिनकी जांच के लिए किया जाता है। हालांकि, प्रक्रियात्मक मायोसिन के लिए तीन-बीड्स यूएफआईसीएस परख को प्राथमिकता देने के कई कारण हैं। सबसे पहले, एक्टिन-मायोसिन बाइंडिंग के ठीक बाद लोड का तेजी से आवेदन गैर-प्रक्रियात्मक मोटर्स के रूप में बल विकास में शुरुआती घटनाओं के माप की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रोसेसिव मोटर्स के मामले में यह मोटर की रन लंबाई और उनकी प्रगति के माध्यम से निरंतर बल के तहत चलने की अवधि का सटीक माप भी देता है (चित्रा 1 बी)। इसके अलावा, बल प्रतिक्रिया की उच्च दर के कारण, सिस्टम स्थिति में तेजी से बदलाव के दौरान बल स्थिर रख सकता है, जैसे कि मायोसिन वर्किंग स्ट्रोक, जिससे मोटर स्टेपिंग के दौरान निरंतर भार की गारंटी मिलती है। सिस्टम का उच्च-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन उप-एमएस इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, जिससे एक्टिन के लिए मायोसिन के कमजोर बंधन की जांच की संभावना खुल जाती है। अंत में, परख ज्यामिति गारंटी देती है कि बल को एक्टिन फिलामेंट के साथ लागू किया जाता है, जिसमें बल के नगण्य अनुप्रस्थ और ऊर्ध्वाधर घटक होते हैं। यह बिंदु विशेष रूप से प्रासंगिक है क्योंकि ऊर्ध्वाधर बल घटक को मोटर के कैनेटीक्स 7,8 की लोड-निर्भरता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। इस तकनीक का उपयोग करके, हम प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 बी के लिए सहायक और प्रतिरोधक भार की एक श्रृंखला लागू कर सकते हैं औरसीधे बलों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इसकी प्रक्रिया की भार निर्भरता को माप सकते हैं।
जैसा कि चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, इस प्रणाली में एक एकल एक्टिन फिलामेंट डबल ऑप्टिकल ट्वीज़र्स (“डंबल”) के फोकस में फंसे दो पॉलीस्टाइनिन मोतियों के बीच निलंबित हो जाता है। एक असंतुलित शुद्ध बल F = F1-F2 को फिलामेंट पर एक तेज प्रतिक्रिया प्रणाली के माध्यम से लगाया जाता है, जो फिलामेंट को एक दिशा में निरंतर वेग से तब तक चलता है जब तक कि यह उपयोगकर्ता-परिभाषित व्युत्क्रम बिंदु तक नहीं पहुंच जाता है जहां शुद्ध बल विपरीत दिशा में उलट हो जाता है। जब मोटर प्रोटीन फिलामेंट के साथ बातचीत नहीं कर रहा होता है, तो डंबल एक त्रिकोणीय तरंग आकार (चित्रा 1 बी, नीचे पैनल) में आगे और पीछे जाने के लिए स्वतंत्र होता है, जो पेडस्टल मोती को फैलाता है जिस पर एक एकल मोटर प्रोटीन जुड़ा होता है। एक बार बातचीत स्थापित हो जाने के बाद डंबल द्वारा ले जाया जाने वाला बल बहुत तेजी से मोटर प्रोटीन में स्थानांतरित हो जाता है और मोटर बातचीत के समय प्रतिक्रिया प्रणाली द्वारा लागू बल तीव्रता और दिशा के तहत कदम रखकर फिलामेंट को विस्थापित करना शुरू कर देता है, जब तक कि मायोसिन एक्टिन से अलग नहीं हो जाता। फंसे हुए एक्टिन फिलामेंट की ध्रुवीयता पर निर्भर मोटर के कदम से उत्पन्न विस्थापन होने के नाते, लागू बल की दिशा के अनुसार भार या तो सहायक हो सकता है, यानी, मोटर विस्थापन की एक ही दिशा में धक्का देना (चित्रा 1 बी ऊपरी पैनल में धक्का), या प्रतिरोधक, यानी, मोटर विस्थापन के संबंध में विपरीत दिशा में खींचना (चित्रा 1 बी में खींचना) ऊपरी पैनल) लागू भार की तीव्रता और दिशात्मकता दोनों द्वारा मोटर प्रक्रिया के केमोमैकेनिकल विनियमन का अध्ययन करना संभव बनाता है।
अगले खंडों में अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी सेटअप के साथ विभिन्न भार के तहत एक्टिन-मायोसिन -5 बी इंटरैक्शन को मापने के लिए सभी चरणों का पूरी तरह से वर्णन किया गया है, जिसमें 1) ऑप्टिकल सेटअप की स्थापना, ऑप्टिकल ट्रैप संरेखण और अंशांकन प्रक्रियाएं, 2) नमूना कक्ष में सभी घटकों और उनकी असेंबली की तैयारी, 3) माप प्रक्रिया, 4) महत्वपूर्ण भौतिक मापदंडों को निकालने के लिए प्रतिनिधि डेटा और डेटा विश्लेषण, जैसे रन की लंबाई, चरण आकार और मोटर प्रोटीन का वेग।
यद्यपि एकल अणु तकनीक, जैसे कि तीन-मोती परख, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और कम थ्रूपुट हैं, यूएफएफसीएस डेटा के उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के लिए आणविक इंटरैक्शन का पता लगाने में सुधार करता है। यूएफएफसीएस मो…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा अनुदान समझौते संख्या 871124 लेजरलैब-यूरोप के तहत, इतालवी विश्वविद्यालय और अनुसंधान मंत्रालय (एफआईआरबी “फ्यूचरो इन राइसर्का” 2013 ग्रांट नंबर आरबीएफआर 13 वी 4 एम 2) और एंटे कसा डी रिस्पार्मियो डी फायरेंज़ द्वारा समर्थित किया गया था। ए.वी. काशचुक को ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम क्रॉस-डिसिप्लिनरी फैलोशिप एलटी008/2020-सी द्वारा समर्थित किया गया था।
Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
Acetone | Sigma | 32201 | |
Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
ATP | Sigma | A7699 | |
Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
BSA | Sigma | B4287 | |
Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
Glucose | Sigma | G7528 | |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
MgCl2 | Fluka | 63020 | |
Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
MOPS | Sigma | M1254 | |
Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
Streptavidin protein | Sigma | 189730 |