In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie
Summary
De huidige studie biedt gedetailleerde in vitro ubiquitylatie assay protocollen voor de analyse van E3 ubiquitine ligase katalytische activiteit. Recombinante eiwitten werden tot expressie gebracht met behulp van prokaryote systemen zoals Escherichia coli-cultuur.
Abstract
De covalente hechting van ubiquitine (Ub) aan interne lysineresidu(en) van een substraateiwit, een proces dat ubiquitylatie wordt genoemd, vertegenwoordigt een van de belangrijkste posttranslationele modificaties in eukaryote organismen. Ubiquitylatie wordt gemedieerd door een sequentiële cascade van drie enzymklassen, waaronder ubiquitine-activerende enzymen (E1-enzymen), ubiquitine-conjugaterende enzymen (E2-enzymen) en ubiquitine-ligases (E3-enzymen) en soms ubiquitine-keten elongatiefactoren (E4-enzymen). Hier worden in vitro protocollen voor ubiquitylatie-assays verstrekt, die de beoordeling van E3-ubiquitineligase-activiteit, de samenwerking tussen E2-E3-paren en substraatselectie mogelijk maken. Samenwerkende E2-E3-paren kunnen worden gescreend door de generatie van vrije poly-ubiquitineketens en/of auto-ubiquitylatie van het E3-ligase te monitoren. Substraat alomtegenwoordigheid wordt gedefinieerd door selectieve binding van het E3-ligase en kan worden gedetecteerd door western blotting van de in vitro reactie. Verder wordt een E2~Ub-lozingstest beschreven, wat een nuttig hulpmiddel is voor de directe beoordeling van functionele E2-E3-samenwerking. Hier wordt de E3-afhankelijke overdracht van ubiquitine gevolgd van het overeenkomstige E2-enzym naar vrije lysine-aminozuren (het nabootsen van substraat-ubiquitylatie) of interne lysines van het E3-ligase zelf (auto-ubiquitylatie). Kortom, er worden drie verschillende in vitro protocollen verstrekt die snel en gemakkelijk uit te voeren zijn om de E3 ligase katalytische functionaliteit aan te pakken.
Introduction
Ubiquitylatie is het proces waarbij Ub covalent wordt gekoppeld aan een substraateiwit1. De Ub-modificatie wordt gekatalyseerd door opeenvolgende enzymatische reacties met de werking van drie verschillende enzymklassen, d.w.z.Ub-activerende enzymen (E1s), Ub-conjugaterende enzymen (E2s), Ub-ligases (E3s) en mogelijk Ub-ketenverlengingsfactoren (E4s)2,3,4,5. Na adenosinetrifosfaat (ATP)- en magnesium (Mg2+)-afhankelijke activering van Ub door E1, valt de actieve site cysteïne van E1 de C-terminale glycine van Ub aan en vormt een thioestercomplex (Ub ~ E1). De energie die wordt onttrokken aan ATP-hydrolyse zorgt ervoor dat de Ub een overgangstoestand met hoge energie bereikt, die gedurende de volgende enzymcascade wordt gehandhaafd. Vervolgens brengt het E2-enzym de geactiveerde Ub over naar zijn interne katalytische cysteïne, waardoor een voorbijgaande Ub ~ E2-thioesterbinding wordt gevormd. Vervolgens wordt Ub overgebracht naar het substraateiwit.
Dit kan op twee manieren. Ofwel kan de E3 ligase eerst binden aan E2, ofwel de E3 ligase kan direct binden Ub. De laatste manier resulteert in de vorming van een E3~Ub intermediair. In beide gevallen is Ub gekoppeld aan het substraateiwit door de vorming van een isopeptidebinding tussen de C-terminale carboxylgroep van Ub en de lysine Ɛ-aminogroep van het substraat6. Het menselijk genoom codeert voor twee E1’s, ongeveer 40 E2’s en meer dan 600 vermeende ubiquitine-ligases7. Op basis van het Ub-overdrachtsmechanisme van de E3 zijn Ub-ligases onderverdeeld in drie categorieën met betrekking tot homologe tot E6AP C-Terminus (HECT)-type, Really Interesting New Gene (RING) / U-box-type en RING tussen RING (RBR) -type ligases8. In deze studie wordt de U-box met ligase, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), gebruikt als representatief E3-enzym. In tegenstelling tot HECT-type E3 enzymen die Ub~E3 thioesters vormen, bindt het U-box domein van CHIP E2~Ub en bevordert de daaropvolgende Ub/substraat overdracht direct van het E2 enzym8,9. Op basis van het belang van de U-box voor de enzymatische functie, wordt een inactieve CHIP U-box mutant, CHIP (H260Q), gebruikt als een controle. CHIP (H260Q) bindt niet aan zijn verwante E2’s, waardoor zijn E3-ligaseactiviteitverloren gaat 10.
Eiwit ubiquitylatie speelt een cruciale rol bij het reguleren van een veelheid aan cellulaire gebeurtenissen in eukaryote cellen. De diversiteit van cellulaire uitkomsten die worden bevorderd door de omkeerbare hechting van Ub-moleculen aan substraateiwitten kan worden toegeschreven aan de moleculaire kenmerken van Ub. Omdat Ub zelf zeven lysine (K) residuen bevat voor verdere alomtegenwoordigheid, is er een rijke verscheidenheid aan Ub-ketentypen met verschillende maten en/of topologieën11. Substraten kunnen bijvoorbeeld worden gewijzigd door een enkel Ub-molecuul op één (mono-ubiquitylatie) of meerdere lysines (multi mono-ubiquitylatie), en zelfs door Ub-ketens (poly-ubiquitylatie)11. Ub-ketens worden homo- of heterotypisch gevormd via dezelfde of verschillende lysineresiduen van Ub, wat zelfs kan resulteren in vertakte Ub-ketens9. Eiwit-alomtegenwoordigheid leidt dus tot diverse arrangementen van Ub-moleculen die specifieke informatie verstrekken, bijvoorbeeldvoor afbraak, activering of lokalisatie van geconjugeerde eiwitten12,13. Deze verschillende Ub-signalen maken een snelle herprogrammering van cellulaire signaalroutes mogelijk, wat een belangrijke vereiste is voor het vermogen van de cel om te reageren op veranderende omgevingsbehoeften.
Een centraal aspect van alomtegenwoordigheid is gerelateerd aan eiwitkwaliteitscontrole. Verkeerd gevouwen of onomkeerbaar beschadigde eiwitten moeten worden afgebroken en vervangen door nieuw gesynthetiseerde eiwitten om eiwithomeostase of proteostase te behouden14. De kwaliteitscontrole E3 ligase, CHIP, werkt samen met moleculaire chaperonnes in de Ub-afhankelijke afbraak van beschadigde eiwitten9,15,16,17. Afgezien daarvan reguleert CHIP de stabiliteit van de myosine-gerichte chaperonne, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), die nauw is gecoördineerd met de spierfunctie en afwijkingen van de optimale niveaus leiden tot menselijke myopathie18,19,20,21. Degradatie van UNC-45B door het 26S-proteasoom wordt gemedieerd door bevestiging van een K48-gekoppelde poly-Ub-keten9. Bij afwezigheid van substraateiwitten voert CHIP auto-ubiquitylatie10,22,23uit,wat kenmerkend is voor RING / U-box E3 ubiquitine-ligases24,25 en wordt beschouwd als het reguleren van ligase-activiteit26. Toepassing van de in vitro ubiquitylatie-assaymethoden beschreven in dit artikel hielp bij het systematisch identificeren van E2-enzymen die samenwerken met CHIP om de vorming van vrije poly-Ub-ketens en / of auto-ubiquitylatie van CHIP te bevorderen (protocolsectie 2). Bovendien werd CHIP-afhankelijke alomtegenwoordigheid van UNC-45B waargenomen, wat een bekend substraat is van het E3-ligase18,19 (protocolsectie 3). Uiteindelijk werd chip-afhankelijke overdracht van geactiveerde Ub van de Ub~E2 thioester gecontroleerd (protocol sectie 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft basale in vitro ubiquitylatiemethoden voor de analyse van de E3-ligasefunctie. Bij het uitvoeren van in vitro ubiquitylatietests moet er rekening mee worden gehouden dat sommige E2-enzymen auto-ubiquitylatie kunnen uitvoeren als gevolg van de aanval van hun actieve cysteïne op hun eigen lysineresiduen die zich in de nabijheid van de actieve site bevinden30. Om dit probleem te omzeilen, wordt het gebruik van een E2-mutant aanbevolen waarbij het respectieve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de leden van ons laboratorium voor de kritische discussie en het nuttige advies over het manuscript. We verontschuldigen ons voor het feit dat we geen waardevolle bijdragen hebben genoemd vanwege de beperking van de grootte. Dit werk wordt ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 en Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD naar TH. Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) in het kader van de Duitse Excellence Strategy – EXC 2030 – 390661388 en – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
References
- Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: ‘one size’ doesn’t fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
- Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
- Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
- Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
- Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
- Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
- Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
- Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
- Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
- Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
- Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
- Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
- Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
- Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
- Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
- Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
- Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
- Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
- Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
- Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
- Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
- Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
- Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
- Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
- Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
- Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
- McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
- Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).
