In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa
Summary
El presente estudio proporciona protocolos detallados de ensayo de ubiquitilación in vitro para el análisis de la actividad catalítica de la ubiquitina ligasa E3. Las proteínas recombinantes se expresaron utilizando sistemas procariotas como el cultivo de Escherichia coli.
Abstract
La unión covalente de la ubiquitina (Ub) a los residuos internos de lisina de una proteína de sustrato, un proceso denominado ubiquitilación, representa una de las modificaciones post-traduccionales más importantes en los organismos eucariotas. La ubiquitilación está mediada por una cascada secuencial de tres clases de enzimas, incluidas las enzimas activadoras de ubiquitina (enzimas E1), las enzimas conjugantes de ubiquitina (enzimas E2) y las ligasas de ubiquitina (enzimas E3) y, a veces, los factores de elongación de la cadena de ubiquitina (enzimas E4). Aquí, se proporcionan protocolos in vitro para ensayos de ubiquitilación, que permiten la evaluación de la actividad de la ubiquitina ligasa E3, la cooperación entre pares E2-E3 y la selección de sustratos. Los pares E2-E3 que cooperan se pueden detectar mediante el monitoreo de la generación de cadenas libres de poli-ubiquitina y / o la auto-ubiquitilación de la ligasa E3. La ubiquitilación del sustrato se define por la unión selectiva de la ligasa E3 y puede detectarse mediante western blotting de la reacción in vitro. Además, se describe un ensayo de descarga E2 ~ Ub, que es una herramienta útil para la evaluación directa de la cooperación funcional E2-E3. Aquí, la transferencia de ubiquitina dependiente de E3 se sigue desde la enzima E2 correspondiente a aminoácidos de lisina libre (imitando la ubiquitilación del sustrato) o lisinas internas de la propia ligasa E3 (auto-ubiquitilación). En conclusión, se proporcionan tres protocolos in vitro diferentes que son rápidos y fáciles de realizar para abordar la funcionalidad catalítica de la ligasa E3.
Introduction
La ubiquitilación es el proceso por el cual Ub se une covalentemente a una proteína de sustrato1. La modificación de Ub es catalizada por sucesivas reacciones enzimáticas que involucran la acción de tres clases diferentes de enzimas, es decir,enzimas activadoras de Ub (E1s), enzimas conjugantes de Ub (E2s), ligasas de Ub (E3s) y posiblemente factores de elongación de la cadena ub (E4s)2,3,4,5. Después de la activación dependiente de trifosfato de adenosina (ATP) y magnesio (Mg2+)de Ub por E1, la cisteína del sitio activo de E1 ataca la glicina C-terminal de Ub, formando un complejo tioéster (Ub ~ E1). La energía extraída de la hidrólisis de ATP hace que el Ub alcance un estado de transición de alta energía, que se mantiene a lo largo de la siguiente cascada de enzimas. A continuación, la enzima E2 transfiere el Ub activado a su cisteína catalítica interna, formando así un enlace tioéster Ub ~ E2 transitorio. Posteriormente, Ub se transfiere a la proteína del sustrato.
Esto se puede hacer de dos maneras. La ligasa E3 puede unirse primero a E2, o la ligasa E3 puede unirse directamente a Ub. Esta última forma da como resultado la formación de un intermedio E3 ~ Ub. En cualquier caso, Ub está unido a la proteína sustrato mediante la formación de un enlace isopéptido entre el grupo carboxilo C-terminal de Ub y el grupo lisina Ɛ-amino del sustrato6. El genoma humano codifica dos E1, aproximadamente 40 E2, y más de 600 ligasas de ubiquitina putativas7. Sobre la base del mecanismo de transferencia ub del E3, las ligasas de Ub se dividen en tres categorías que involucran ligasas homólogas a E6AP C-Terminus (HECT), really interesting New Gene (RING)/U-box-type y RING entre ligasas de tipo RING (RBR)8. En este estudio, la caja U que contiene ligasa, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), se utiliza como una enzima E3 representativa. En contraste con las enzimas E3 de tipo HECT que forman tioésteres Ub ~ E3, el dominio U-box de CHIP se une a E2 ~ Ub y promueve la posterior transferencia Ub / sustrato directamente desde la enzima E28,9. Basado en la importancia de la U-box para la función enzimática, un mutante chip U-box inactivo, CHIP(H260Q), se utiliza como control. CHIP(H260Q) no se une a sus E2 cognados, perdiendo así su actividad de ligasa E310.
La ubiquitilación de proteínas juega un papel crucial en la regulación de una multitud de eventos celulares en las células eucariotas. La diversidad de resultados celulares que son promovidos por la unión reversible de las moléculas de Ub a las proteínas de sustrato se puede atribuir a las características moleculares de Ub. Como la propia Ub contiene siete residuos de lisina (K) para una mayor ubiquitilación, existe una rica variedad de tipos de cadenas de Ub con diferentes tamaños y/o topologías11. Por ejemplo, los sustratos pueden ser modificados por una sola molécula de Ub en una (mono-ubiquitilación) o múltiples lisinas (multi mono-ubiquitilación), e incluso por cadenas de Ub (poli-ubiquitilación)11. Las cadenas de Ub se forman homo o heterotípicamente a través de los mismos o diferentes residuos de lisina de Ub, lo que incluso podría dar lugar a cadenas de Ub ramificadas9. Por lo tanto, la ubiquitilación de proteínas conduce a diversos arreglos de moléculas de Ub que proporcionan información específica, por ejemplo,para la degradación, activación o localización de proteínas conjugadas12,13. Estas diferentes señales Ub permiten una reprogramación rápida de las vías de señalización celular, que es un requisito importante para la capacidad de la célula para responder a las necesidades ambientales cambiantes.
Un aspecto central de la ubiquitilación está relacionado con el control de calidad de las proteínas. Las proteínas mal plegadas o dañadas irreversiblemente deben ser degradadas y reemplazadas por proteínas recién sintetizadas para mantener la homeostasis o proteostasis de las proteínas14. La ligasa E3 de control de calidad, CHIP, colabora con chaperonas moleculares en la degradación dependiente de Ub de proteínas dañadas9,15,16,17. Aparte de eso, CHIP regula la estabilidad de la chaperona dirigida por miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), que está estrechamente coordinada con la función muscular y las desviaciones de los niveles óptimos conducen a la miopatía humana18,19,20,21. La degradación de UNC-45B por el proteasoma 26S está mediada por la unión de una cadena poli-Ub ligada a K489. En ausencia de proteínas de sustrato, CHIP realiza la auto-ubiquitilación10,22,23,que es característica de las ligasas de ubiquitina RING/U-box E324,25 y se considera que regula la actividad de la ligasa26. La aplicación de los métodos de ensayo de ubiquitilación in vitro descritos en este artículo ayudó a identificar sistemáticamente las enzimas E2 que se asocian con CHIP para promover la formación de cadenas libres de poli-Ub y / o la auto-ubiquitilación de CHIP (protocolo sección 2). Además, se observó ubiquitilación dependiente de CHIP de UNC-45B, que es un sustrato conocido de la ligasa E318,19 (protocolo sección 3). En última instancia, se monitorizó la transferencia dependiente de CHIP de Ub activado desde el tioéster Ub~E2 (sección 4 del protocolo).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe los métodos básicos de ubiquitilación in vitro para el análisis de la función de la ligasa E3. Al realizar ensayos de ubiquitilación in vitro, se debe considerar que algunas enzimas E2 pueden realizar auto-ubiquitilación debido al ataque de su cisteína activa sobre sus propios residuos de lisina que se encuentran muy cerca del sitio activo30. Para evitar este problema, se recomienda el uso de un mutante E2 en el que el residuo de lisina respectivo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio por la discusión crítica y los consejos útiles sobre el manuscrito. Nos disculpamos por no haber citado contribuciones valiosas debido a la limitación de tamaño. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 y Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD a TH. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania – EXC 2030 – 390661388 y – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 a T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
References
- Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: ‘one size’ doesn’t fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
- Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
- Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
- Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
- Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
- Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
- Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
- Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
- Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
- Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
- Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
- Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
- Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
- Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
- Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
- Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
- Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
- Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
- Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
- Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
- Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
- Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
- Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
- Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
- Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
- Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
- McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
- Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).
