In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi
Summary
Bu çalışma, E3 ubiquitin ligase katalitik aktivitesinin analizi için ayrıntılı in vitro ubiquitylation tahlil protokolleri sunmaktadır. Rekombinant proteinler Escherichia coli kültürü gibi prokaryotik sistemler kullanılarak ifade edildi.
Abstract
Ubiquitin’in (Ub) substrat proteininin iç lizin kalıntılarına, her yerde bulunan bir işlem olarak adlandırılan bir işleme bağlanması, ökaryotik organizmalardaki en önemli çeviri sonrası değişikliklerden birini temsil eder. Her yerde bulunan, ubiquitin aktive edici enzimler (E1 enzimleri), ubiquitin-konjugating enzimleri (E2 enzimleri) ve ubiquitin ligazları (E3 enzimleri) ve bazen de ubiquitin zinciri uzama faktörleri (E4 enzimleri) dahil olmak üzere üç enzim sınıfından oluşan sıralı bir basamaklama ile aracılık edilir. Burada, E3 ubiquitin ligaz aktivitesinin değerlendirilmesine, E2-E3 çiftleri arasındaki işbirliğine ve substrat seçimine olanak sağlayan her yerde bulunan tahliller için in vitro protokoller sağlanmaktadır. İşbirliği yapan E2-E3 çiftleri, ücretsiz poli-ubiquitin zincirlerinin ve/veya E3 ligase’in otomatik olarak her yerde bulunmasına dikkat edilerek taranabilir. Substrat her yerde bulunan, E3 ligazın seçici bağlanması ile tanımlanır ve in vitro reaksiyonun batı lekesi ile tespit edilebilir. Ayrıca, fonksiyonel E2-E3 işbirliğinin doğrudan değerlendirilmesi için yararlı bir araç olan bir E2 ~ Ub deşarj tahlilleri açıklanmıştır. Burada, E3 bağımlı ubiquitin transferi, ilgili E2 enziminden serbest lizin amino asitlerine (her yerde bulunan substratı taklit eden) veya E3 ligazının iç lizinlerine (otomatik her yerde bulunan) takip edilir. Sonuç olarak, E3 ligaz katalitik işlevselliğini ele almak için hızlı ve gerçekleştirilmesi kolay üç farklı in vitro protokol sağlanmaktadır.
Introduction
Ubiquitylation, Ub’in bir substrat proteinine birlikte bağlandığı süreçtir1. Ub modifikasyonu, üç farklı enzim sınıfının, yaniUb aktive edici enzimlerin (E1’ler), Ub-konjugating enzimlerinin (E2s), Ub ligases (E3s) ve muhtemelen Ub zincir uzama faktörlerinin (E4s)2,3,4,5’inetkisini içeren ardışık enzymatic reaksiyonlarla katalizöre edilir. Adenozin trifosfat (ATP)- ve magnezyumdan (Mg2+)- Ub’un E1 tarafından bağımlı aktivasyonundan sonra, E1’in aktif bölge sisteini Ub’un C terminali glisinine saldırarak bir tiyoester kompleksi oluşturur (Ub ~ E1). ATP hidrolizinden alınan enerji, Ub’un aşağıdaki enzim kaskadı boyunca tutulan yüksek enerji geçiş durumuna geçmesine neden olur. Daha sonra, E2 enzimi aktif Ub’yi iç katalitik sisteinine aktarır ve böylece geçici bir Ub ~ E2 tiyoester bağı oluşturur. Daha sonra, Ub substrat proteinine aktarılır.
Bu iki şekilde yapılabilir. E3 ligase önce E2’ye bağlanabilir veya E3 ligase doğrudan Ub’a bağlanabilir. İkinci yol bir E3 ~ Ub ara oluşumu ile sonuçlanır. Her iki durumda da, Ub, Ub’nin C-terminal karboksil grubu ile substratın lizin Ɛ-amino grubu arasında bir izopenptid bağının oluşumu ile substrat proteinine bağlanır6. İnsan genomları iki E1, yaklaşık 40 E2 ve 600’den fazla putatif ubiquitin ligases7kodlar. E3’ün Ub transfer mekanizmasına dayanarak, Ub ligases Homologous ila E6AP C-Terminus (HECT)- tipi, Gerçekten İlginç Yeni Gen (RING)/U-box tipi ve RING (RBR) tipi bağlar arasındaki RING8‘i içeren üç kategoriye ayrılır. Bu çalışmada, ligaz içeren U kutusu, HSC70 etkileşimli Proteinin (CHIP) Karboksil Terminus’u temsili bir E3 enzimi olarak kullanılmaktadır. Ub ~ E3 tiyosesterlerini oluşturan HECT tipi E3 enzimlerinin aksine, CHIP’in U kutusu etki alanı E2 ~ Ub’yi bağlar ve sonraki Ub / substrat transferini doğrudan E2 enziminden8,9. U kutusunun enzymatic fonksiyon için önemine dayanarak, etkin olmayan bir CHIP U kutusu mutant, CHIP (H260Q), bir kontrol olarak kullanılır. CHIP (H260Q) konyak E2’lerine bağlanamaz, böylece E3 ligaz aktivitesinikaybeder 10.
Protein her yerde bulunma, ökaryotik hücrelerde çok sayıda hücresel olayın düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Ub moleküllerinin proteinleri substrata geri dönüşümlü olarak bağlaması ile teşvik edilen hücresel sonuçların çeşitliliği Ub’in moleküler özelliklerine bağlanabilir. Ub’un kendisi daha fazla her yerde bulunan yedi lizin (K) kalıntısı içerdiğinden, farklı boyutlarda ve / veya topolojilere sahip zengin Ub zincir türleri çeşitliliği vardır11. Örneğin, substratlar tek bir Ub molekülü tarafından tek bir Ub molekülü (mono-her yerde) veya çoklu lizinler (çoklu mono-her yerde) ve hatta Ub zincirleri (poli-her yerde)11ile değiştirilebilir. Ub zincirleri, Ub’nin aynı veya farklı lizin kalıntıları aracılığıyla homo veya heterotipik olarak oluşur, bu da dallı Ub zincirleri9ile bile sonuçlanabilir. Bu nedenle, protein her yerde bulunma, Ub moleküllerinin, örneğinkonjuge proteinlerin bozulması, aktivasyonu veya lokalizasyonu için belirli bilgiler sağlayan çeşitli düzenlemelerine yol açar12,13. Bu farklı Ub sinyalleri, hücresel sinyal yollarının hızlı bir şekilde yeniden programlanmasını sağlar ve bu da hücrenin değişen çevresel ihtiyaçlara yanıt verebilmesi için önemli bir gerekliliktir.
Her yerde bulunanın merkezi bir yönü protein kalite kontrolü ile ilgilidir. Yanlış katlanmış veya geri döndürülemez şekilde zarar görmüş proteinler bozulmalı ve protein homeostazını veya proteostazını korumak için yeni sentezlenmiş proteinlerle değiştirilmelidir14. Kalite kontrolü E3 ligase, CHIP, hasarlı proteinlerinUb’abağlı bozulmasında moleküler refakatçilerle işbirliği yapıyor 9,15,16,17. Bunun dışında CHIP, kas fonksiyonu ile sıkı bir şekilde koordine edilen ve optimum seviyelerden sapmalar insan miyopatisine yol açan18, 19,20,21olan miyosin yönlendirilmiş refakatçi UNC-45B’nin (Unc-45 Homolog B) stabilitesini düzenler. UNC-45B’nin 26S proteazom tarafından bozulması, K48 bağlantılı bir poli-Ub zincirininbağlanmasıyla aracılıkedilir 9 . Substrat proteinlerinin yokluğunda CHIP, RING/U-box E3 ubiquitin ligases 24,25’inkarakteristiği olan ve ligase aktivitesini düzenlediği düşünülen10,22, 23 otomatik her yerde10 , 22,23 ‘ ü gerçekleştirir. Bu makalede açıklanan in vitro her yerde test yöntemlerinin uygulanması, chip’in serbest poli-Ub zincirlerinin oluşumunu ve/veya otomatik olarak her yerde oluşturulmasını teşvik etmek için CHIP ile birlikte gelen E2 enzimlerinin sistematik olarak tanımlanmasına yardımcı oldu (protokol bölüm 2). Ayrıca, E3 ligaz18,19’un bilinen bir alt tabakası olan UNC-45B’nin CHIP’e bağımlı her yerde olduğu gözlenmiştir (protokol bölüm 3). Sonuç olarak, etkinleştirilen Ub’nin Ub ~E2 tiyoesterinden CHIP’e bağımlı transferi izlendi (protokol bölüm 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede E3 ligaz fonksiyonunun analizi için temel in vitro her yerde bulunma yöntemleri açıklanmaktadır. In vitro her yerde tahlili tahlilleri yapılırken, bazı E2 enzimlerinin aktif sitsteinlerinin aktif bölgeye yakın bulunan kendi lizin kalıntılarına saldırması nedeniyle otomatik her yerde bulunma gerçekleştirebileceği düşünülmelidir30. Bu sorunu atlatmak için, ilgili lizin kalıntısının arginin ile değiştirildiği bir E2 mutantının kullanılmas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuvarımız üyelerine makale hakkında eleştirel tartışmalar ve yararlı tavsiyeler için teşekkür ederiz. Boyut sınırlaması nedeniyle değerli katkıları belirtmediğimiz için özür dileyeceğiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 ve Mükemmellik Kümesi EXC 229/ CECAD to TH tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi – EXC 2030 – 390661388 ve – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 bir T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
References
- Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: ‘one size’ doesn’t fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
- Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
- Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
- Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
- Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
- Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
- Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
- Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
- Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
- Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
- Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
- Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
- Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
- Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
- Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
- Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
- Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
- Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
- Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
- Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
- Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
- Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
- Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
- Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
- Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
- Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
- McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
- Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).
