במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז
Summary
המחקר הנוכחי מספק פרוטוקולים מפורטים במבחנה בכל מקום לבדיקת אנליזה לניתוח של E3 אוביקוויטין פעילות קטליטית ligase. חלבונים רקומביננטיים באו לידי ביטוי במערכות פרוקריוטיות כגון תרבות קולי Escherichia.
Abstract
החיבור הקוולנטי של אוביקוויטין (Ub) לשאריות ליזינה פנימיות של חלבון מצע, תהליך המכונה בכל מקום, מייצג את אחד השינויים הפוסט-תרגומיים החשובים ביותר באורגניזמים אאוקריוטים. Ubiquitylation מתווך על ידי מפל רציף של שלושה מחלקות אנזימים כולל אנזימים מפעילי אוביקוויטין (אנזימי E1), אנזימים ההולכים אוביקוויטין (אנזימי E2) ורצועות אוביקוויטין (אנזימי E3), ולפעמים, גורמי התארכות בשרשרת אוביקוויטין (אנזימי E4). כאן, בפרוטוקולים במבחנה לבדיקות בכל מקום מסופקים, המאפשרים הערכה של E3 אוביקוויטין פעילות ligase, שיתוף הפעולה בין זוגות E2-E3, ובחירת מצע. זוגות E2-E3 שיתופיים יכולים להיות מוקרנים על ידי ניטור הדור של רשתות פולי-אוביקוויטין בחינם ו / או כל מקום אוטומטי של ligase E3. מצע בכל העולם מוגדר על ידי כריכה סלקטיבית של ligase E3 והוא יכול להיות מזוהה על ידי סופג מערבי של התגובה במבחנה. יתר על כן, E2 ~ Ub פריקה בדיקה מתוארת, המהווה כלי שימושי להערכה ישירה של שיתוף פעולה פונקציונלי E2-E3. כאן, העברה תלויה E3 של אוביקוויטין מתבצעת מן האנזים E2 המתאים על חומצות אמינו ליצין חינם (חיקוי מצע בכל מקום) או ליזינים פנימיים של E3 ligase עצמו (auto-בכל מקום). לסיכום, שלושה פרוטוקולי במבחנה שונים מסופקים כי הם מהירים וקלים לביצוע כדי לטפל בפונקציונליות קטליטית E3 ligase.
Introduction
בכל מקום הוא התהליך שבו Ub מקושר באופן קוולנטי לחלבוןמצע 1. שינוי Ub מזורז על ידי תגובות אנזימטיות רצופות המערבות פעולה של שלושה מחלקות אנזימים שונות, כלומר., אנזימים מפעילי Ub (E1s), אנזימים ההולכים ub (E2s), ליגסות Ub (E3s) ואולי גורמי התארכות שרשרת Ub (E4s)2,3,4,5. לאחר אדנוסין טריפוספט (ATP)- ומגנזיום (Mg2 +) הפעלה תלויה של Ub על ידי E1, האתר הפעיל ציסטאין של E1 תוקף את גליצין C-מסוף של Ub, ויוצר קומפלקס thioester (Ub ~ E1). האנרגיה שנשאבת מהידרוליזה ATP גורמת ל- Ub להגיע למצב מעבר באנרגיה גבוהה, אשר נשמר לאורך מפל האנזים הבא. לאחר מכן, האנזים E2 מעביר את Ub מופעל לציסטאין הקטליטי הפנימי שלו, ובכך יוצר קשר Ub ~ E2 תיאסטר חולף. לאחר מכן, Ub מועבר לחלבון המצע.
זה יכול להיעשות בשתי דרכים. ייתכן שהליגאז E3 ייקשר תחילה ל- E2, או שליגאז E3 יכול לאגד ישירות את Ub. הדרך האחרונה גורמת להיווצרות של E3 ~ Ub ביניים. בכל מקרה, Ub מקושר לחלבון המצע על ידי היווצרות קשר איזופפטיד בין קבוצת קרבוקסיל C-terminal של Ub לבין קבוצת האמינו ליסין Ɛ של המצע6. הגנום האנושי מקודד שני E1s, כ 40 E2s, ויותר מ 600 פוטטיבי בכל מקום רצועות7. בהתבסס על מנגנון העברת Ub של E3, רצועות Ub מחולקות לשלוש קטגוריות המערבות הומולוגית לסוג E6AP C-Terminus (HECT), גן חדש מעניין באמת (RING)/U-box- type, וטבעת בין רצועות מסוג RING (RBR)8. במחקר זה, U-box המכיל ליגאז, טרמינל קרבוקסיל של חלבון אינטראקציה HSC70 (CHIP), משמש כאנזים E3 מייצג. בניגוד לאנזימי E3 מסוג HECT היוצרים Ub ~ E3 thioesters, תחום U-box של CHIP קושר E2 ~ Ub ומקדם את העברת Ub / מצע הבאים ישירות מן האנזים E28,9. בהתבסס על החשיבות של תיבת U עבור פונקציה אנזימטית, מוטציה U-box שבב לא פעיל, CHIP(H260Q), משמש כפקד. CHIP(H260Q) אינו מצליח להיקשר ל- E2s הקוגנייט שלו, ובכך מאבד את פעילות ה- E3 ligase10.
בכל מקום חלבון ממלא תפקיד מכריע בוויסות שפע של אירועים תאיים בתאים אאוקריוטים. ניתן לייחס את מגוון התוצאות התאיות המקודמות על ידי צירוף הפיך של מולקולות Ub לחלבונים מצעיים למאפיינים המולקולריים של Ub. כמו Ub עצמו מכיל שבעה שאריות ליסן (K) עבור כל כולה נוספת, יש מגוון עשיר של סוגי שרשרת Ub עם גדלים שונים ו / או טופולוגיות11. לדוגמה, מצעים יכולים להשתנות על ידי מולקולת Ub אחת באחת (מונו-נביקולציה) או ליזינים מרובים (multi-mono-ubiquitylation), ואפילו על ידי שרשראות Ub (פולי-ubiquitylation)11. שרשראות Ub נוצרות הומו או הטרוטיפיות באמצעות שאריות ליצין זהות או שונות של Ub, מה שעלול אף לגרום לרשתות Ub מסועפות9. לכן, כל החלבון מוביל לסידורים מגוונים של מולקולות Ub המספקות מידע ספציפי, למשל., עבור השפלה, הפעלה או לוקליזציה של חלבונים מצומדים12,13. אותות Ub שונים אלה מאפשרים תכנות מחדש מהיר של מסלולי איתות תאיים, המהווה דרישה חשובה ליכולתו של התא להגיב לצרכים הסביבתיים המשתנים.
היבט מרכזי של בכל מקום קשור לבקרת איכות חלבון. חלבונים תותומים או פגומים באופן בלתי הפיך חייבים להיות מושפלים ומוחלפים בחלבונים מסונתזים חדשים כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון או פרוטאוסטזיס14. בקרת האיכות E3 ligase, CHIP, משתפת פעולה עם מלווים מולקולריים בהשפלה תלוית Ub של חלבונים פגומים9,15,16,17. חוץ מזה, CHIP מווסת את היציבות של המלווה מכוון מיוסין, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), אשר מתואם היטב עם תפקוד שרירים וחריגות מהרמות האופטימליות להוביל מיופתיה אנושית18,19,20,21. השפלה של UNC-45B על ידי פרוטאסום 26S הוא בתיווך על ידי התקשרות של שרשרת פולי-Ub הקשורה K489. בהיעדר חלבוני מצע, CHIP מבצעת10,22,23,המאפיין את רינג / U-box E3 רצועות אוביקוויטין24,25 ונחשב לווסת פעילות ligase26. יישום שיטות בדיקת ההחמצה המופרכות המתוארות במאמר זה סייע לזהות באופן שיטתי אנזימי E2 המשתלבים עם CHIP כדי לקדם היווצרות של שרשראות פולי-Ub בחינם ו/או כל-כל אוטומטי של CHIP (פרוטוקול סעיף 2). יתר על כן, כל מקום תלוי שבב של UNC-45B נצפתה, שהוא מצע ידוע של E3 ligase18,19 (פרוטוקול סעיף 3). בסופו של דבר, העברה תלוית שבב של Ub מופעל מן Ub ~ E2 thioester היה במעקב (פרוטוקול סעיף 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטות בסיסיות במבחנה בכל העולם לניתוח של פונקציית ligase E3. בעת ביצוע במבחנה בכל מקום בדיקות, יש לקחת בחשבון כי כמה אנזימי E2 יכולים לבצע auto-בכל מקום בשל ההתקפה של ציסטאין הפעיל שלהם על שאריות ליצין שלהם הממוקמים בסמיכות לאתר הפעיל30. כדי לעקוף בעיה זו, השימוש …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על דיון ביקורתי ועצות מועילות על כתב היד. אנו מתנצלים על כך שלא ציינו תרומות יקרות ערך בשל מגבלת גודל. עבודה זו נתמכת על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 ואשכול מצוינות EXC 229 / CECAD ל- TH. עבודה זו מומנה על ידי דויטשה פורשונגסגמיינסכאפט (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה – EXC 2030 – 390661388 ו – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 a T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
References
- Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: ‘one size’ doesn’t fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
- Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
- Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
- Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
- Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
- Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
- Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
- Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
- Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
- Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
- Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
- Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
- Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
- Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
- Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
- Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
- Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
- Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
- Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
- Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
- Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
- Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
- Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
- Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
- Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
- Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
- McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
- Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).
