Automatiseret dissektionsprotokol til tumorberigelse i væv med lavt tumorindhold

Summary

Digital annotation med automatiseret vævsdissektion giver en innovativ tilgang til berigelse af tumor i tilfælde med lavt tumorindhold og kan tilpasses både paraffin og frosne vævstyper. Den beskrevne arbejdsgang forbedrer nøjagtighed, reproducerbarhed og gennemløb og kan anvendes til både forskning og kliniske indstillinger.

Abstract

Tumorberigelse i væv med lavt tumorindhold, dem under 20% tumorindhold afhængigt af metoden, er påkrævet for at generere kvalitetsdata reproducerbart med mange downstream-assays såsom næste generations sekventering. Automatiseret vævsdissektion er en ny metode, der automatiserer og forbedrer tumorberigelse i disse almindelige væv med lavt tumorindhold ved at reducere den brugerafhængige upræcision af traditionel makrodissektion og tids-, omkostnings- og ekspertisebegrænsninger ved laserfangstmikrodissektion ved hjælp af digital billedannoteringsoverlejring på ikke-opnåede dias. Her bruges digitale hæmatoxylin- og eosinannoteringer (H&E) til at målrette mod små tumorområder ved hjælp af et blad, der er 250 μm² i diameter i ufarvet formalinfast paraffinindlejret (FFPE) eller friske frosne sektioner op til 20 μm i tykkelse til automatiseret tumorberigelse inden nukleinsyreekstraktion og hel exom-sekventering (WES). Automatiseret dissektion kan høste kommenterede regioner i væv med lavt tumorindhold fra enkelte eller flere sektioner til nukleinsyreekstraktion. Det giver også mulighed for registrering af omfattende indsamlingsmålinger før og efter høst, samtidig med at nøjagtigheden, reproducerbarheden og gennemstrømningen øges med udnyttelse af færre dias. Den beskrevne protokol muliggør digital annotation med automatiseret dissektion på animalsk og / eller human FFPE eller frisk frosset væv med lavt tumorindhold og kan også bruges til enhver region af interesseberigelse for at øge tilstrækkeligheden til downstream-sekventeringsapplikationer i kliniske eller forskningsmæssige arbejdsgange.

Introduction

Næste generations sekventering (NGS) bruges i stigende grad til både patientpleje og kræftforskning for at hjælpe med at guide behandlinger og lette videnskabelig opdagelse. Væv er ofte begrænset, og små prøver med variabelt tumorindhold anvendes rutinemæssigt. Tumortilstrækkelighed og integritet forbliver derfor en barriere for at opnå meningsfulde data. Prøver med lavere tumorprocenter kan forårsage vanskeligheder med at skelne sande varianter fra sekventeringsartefakter og er ofte ikke berettiget til NGS¹. Tumorberigelse af tilfælde med lavt tumorindhold, dem under 20%, har vist sig at hjælpe med at give tilstrækkeligt materiale til at generere reproducerbare sekventeringsdata og sikre, at lavfrekvente varianter ikke savnes ^2,3. Grænserne vil dog variere afhængigt af de anvendte platforme og planlagt brug af de genererede data.

Traditionelt udføres berigelse af tumorregioner til ekstraktion ved manuel makrodissektion eller laserfangst mikrodissektion (LCM) af formalinfast paraffin indlejret (FFPE) dias. Manuel makrodissering eller skrabning af specificerede vævsområder fra dias gør det muligt at fjerne tumorområder til brug i downstream-assays med relativt lave omkostninger, men med lav nøjagtighed og lav præcision ^2,4. Minimal teknisk nøjagtighed kan være meget effektiv med tilfælde med højere tumorindhold, hvor store tumorskår er til stede og / eller minimalt vævstab ikke påvirker resultaterne væsentligt, men tilfælde med lavt tumorindhold eller tilfælde med mere dispergeret tumor kræver øget præcision. LCM blev derfor opfundet i 1990’erne og blev en værdifuld måde at præcist fjerne små, definerede, mikroskopiske vævsområder fra formalinfast paraffin indlejret (FFPE) dias 5,6,7,8. LCM kan bruges til at indsamle enkeltcellepopulationer, når der findes kompleks heterogenitet af prøven⁹, hvilket giver mulighed for indsamling af tidligere vanskelige at adskille cellepopulationer. LCM kræver dog dyre maskiner, der kræver omfattende teknisk ekspertise og praktisk tid 10,11,12,13,14.

Instrumentet, der anvendes til automatiseret vævsdissektion, har præcision mellem LCM (~ 10 μm) og makrodissektion (~ 1 mm)¹⁵. Derudover udviser den både omkostnings- og tekniske ekspertisekrav mellem makrodissering og LCM og er designet til at udføre hurtig vævsberigelse fra sekventielle FFPE-dias for at afhjælpe ulemperne ved tidligere metoder¹⁵. Automatiseret dissektion på denne måde bruger digitale annoteringer eller billedoverlejringer på scenen på serielt sektionerede ufarvede vævsdias til dissekering og berigelse af interesseområder. Instrumentet bruger plastspindefræsespidser, 1,5 ml opsamlingsrør og kan bruges med en række forskellige væsker til dissektion for at indsamle områder af interesse for downstream-assays inklusive nukleinsyreekstraktion og sekventering. Den roterende plastfræsespids bruger indre og ydre sprøjtetøndereservoirer og et stempel til opsamling af buffer, derefter møller og opsamler væv¹⁶. Den variable fræsespidsstørrelsesdiameter (250 μm, 525 μm, 725 μm) kan muliggøre dissektion af separate vævsområder til sammenligning, multifokale regioner, der kan samles eller individuelle små områder fra enkelte eller flere FFPE-dias. Sektionstykkelser, der anvendes til høst, kan justeres ud fra individuelle forsøgsbehov, og brugerne kan sikre, at områder af interesse ikke er blevet udtømt ved at udføre en ekstra H&E på en seriel sektion umiddelbart efter den sidste sektion, der blev brugt til høst.

Automatiseret dissektion blev identificeret som en måde at berige tumorindhold i tilfælde med lavt tumorindhold, og vi testede og udvidede den tilsigtede funktionalitet af et automatiseret vævsdissektionsinstrument, som i øjeblikket markedsføres til brug på FFPE kliniske prøver op til 10 μm i tykkelse. Arbejdet viser, at automatiseret dissektion kan anvendes på både FFPE og friske frosne humane eller animalske vævssektioner op til 20 μm i tykkelse til forskningsformål. Protokollen demonstrerer også en tilgang til digitalt at kommentere og automatisere dissektion til tumorberigelse i væv med lavt tumorindhold og / eller tilfælde med indlejret, dispergeret tumor, hvor meningsfuld makrodissektion er udfordrende eller ikke mulig og viser både kvalitet og udbytte af nukleinsyre, der er tilstrækkelig til NGS. Automatiseret dissektion kan derfor give præcision på mellemniveau og øget gennemstrømning til tumorberigelse og kan også anvendes til at berige andre regioner af interesse eller kombineres med andre platforme til at besvare forskning eller kliniske spørgsmål.

Protocol

Før initiering skal du indhente passende vævsprøver i henhold til Institutional Review Board (IRB) protokoller. Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Genentech, Inc. 1. Forberedelse af væv og dias Vælg FFPE eller friske frosne vævsblokke, og brug den tilsvarende behandlingsmetode nedenfor. Skær vævsbloksektioner på positivt ladede glasglas i den ønskede tykkelse. Seriel sektion FFPE væv i b…

Representative Results

FFPE- og FF-museleverafsnit indeholdende metastatisk kolorektal cancer i xenotransplantater blev valgt. Sektioner blev H&E farvet (figur 1A, E, I) og scannet på et helt diasbillede ved 20x forstørrelse. En patolog kommenterede digitalt tumorområder af interesse, og en maske blev genereret ved hjælp af kommerciel software og formateret som et digitalt png-referencebillede (figur 1B, F, J). Serielle 10 μm og 20 μm tykke ufar…

Discussion

Præsenteret her er en protokol til anvendelse af digital annotation og automatiseret dissektion til at dissekere tumorregioner fra ffpe med lavt tumorindhold eller friske frosne væv til tumorberigelse og anvendelse i WES. Ved at kombinere digital annotation og maskeoprettelse med automatiseret dissektion reduceres den krævede praktiske tid og ekspertise, der er fælles for klassiske metoder til tumorberigelse inklusive manuel makrodissektion og LCM, betydeligt. Protokollen demonstrerer en potentielt vigtig mellemklass…

Materials

Agilent SureSelectXT	Agilent	G9611A
AVENIO Millisect Fill Station	Roche	8106533001
AVENIO Millisect Instrument, Base	Roche	8106568001
AVENIO Millisect Instrument, Head	Roche	8106550001
AVENIO Millisect Milling Tips Small	Roche	8106509001
AVENIO Millisect PC	Roche	8106495001
BioAnalyzer	Agilent	G2939BA
Eppendorf 5427R	Eppendorf	22620700	Micro-centrifuge
Incubation Buffer	Promega	D920D
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010	Automated stainer
Molecular Grade Mineral Oil	Sigma	M5904-500ML
Proteinase K	Promega	V302B	Digestion buffer
Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80284
RLT Plus buffer	Qiagen	80204
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214