פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה
Summary
ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית של רקמות מספק גישה חדשנית להעשרת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה וניתן להתאמה הן לסוגי פרפין והן לסוגי רקמות קפואות. זרימת העבודה המתוארת משפרת את הדיוק, יכולת השכפול והתפוקה וניתן ליישם אותה הן על הגדרות המחקר והן על ההגדרות הקליניות.
Abstract
העשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה, אלה שמתחת לתכולת הגידול של 20% בהתאם לשיטה, נדרשת כדי להפיק נתונים איכותיים באופן משוחזר עם בדיקות רבות במורד הזרם כגון ריצוף הדור הבא. כריתת רקמות אוטומטית היא מתודולוגיה חדשה שהופכת ומשפרת את העשרת הגידולים ברקמות הנפוצות והנמוכות הללו על ידי הפחתת חוסר הדיוק התלוי במשתמש של ניתוח מאקרו מסורתי ומגבלות זמן, עלות ומומחיות של מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר על-ידי שימוש בשכבת-על של ביאור תמונה דיגיטלי על גבי שקופיות לא מוכתמות. כאן, ביאורים דיגיטליים של המטוקסילין ואאוזין (H&E) משמשים כדי להתמקד באזורי גידול קטנים באמצעות להב בקוטר 250 מיקרומטר2 בפרפין קבוע פורמלין לא מוכתם משובץ (FFPE) או מקטעים קפואים טריים בעובי של עד 20 מיקרומטר להעשרת גידולים אוטומטית לפני מיצוי חומצות גרעין וריצוף אקסום שלם (WES). כריתה אוטומטית יכולה לקצור אזורים מבוארים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה מקטעים בודדים או מרובים למיצוי חומצות גרעין. הוא גם מאפשר לכידה של מדדי איסוף נרחבים לפני ואחרי הקציר תוך שיפור הדיוק, יכולת השכפול והגדלת התפוקה תוך ניצול של פחות שקופיות. הפרוטוקול המתואר מאפשר ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית על FFPE של בעלי חיים ו/או בני אדם או רקמות קפואות טריות עם תכולת גידול נמוכה ויכול לשמש גם לכל אזור העשרת עניין כדי להגביר את ההלימה ליישומי ריצוף במורד הזרם בתהליכי עבודה קליניים או מחקריים.
Introduction
ריצוף הדור הבא (NGS) מנוצל יותר ויותר הן לטיפול בחולים והן לחקר הסרטן כדי לסייע בהנחיית טיפולים ובהקלה על גילוי מדעי. רקמה היא לעתים קרובות מוגבלת ודגימות קטנות עם תוכן גידול משתנה משמשים באופן שגרתי. הלימות הגידול ושלמותו, אם כן, נותרו מחסום להשגת נתונים משמעותיים. דגימות עם אחוזי גידול נמוכים יותר עלולות לגרום לקושי להבחין בין וריאנטים אמיתיים לבין ממצאי ריצוף ולעתים קרובות אינן זכאיות ל- NGS1. העשרת גידולים של מקרים בעלי תכולת גידול נמוכה, אלה הנמוכים מ-20%, הוכחה כמסייעת להניב מספיק חומר על מנת לייצר נתוני ריצוף הניתנים לשחזור ולהבטיח שגרסאות בתדר נמוך לא יחמיצו 2,3. עם זאת, המגבלות ישתנו בהתאם לפלטפורמות המשמשות והשימוש המתוכנן בנתונים שנוצרו.
באופן מסורתי, העשרה של אזורי גידול למיצוי מתבצעת על ידי מקרודיסקציה ידנית או מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) של שקופיות מוטבעות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). מקרו-דיסקציה ידנית, או גירוד אזורי רקמה מוגדרים משקופיות, מאפשרת להסיר אזורי גידול לשימוש בבדיקות במורד הזרם בעלות נמוכה יחסית, אך עם דיוק נמוך ודיוק נמוך 2,4. דיוק טכני מינימלי יכול להיות יעיל מאוד במקרים של תכולת גידול גבוהה יותר בהם קיימים חלקים גדולים של גידול ו/או אובדן רקמות מינימלי אינו משפיע באופן משמעותי על התוצאות, אך מקרים של תכולת גידול נמוכה או מקרים עם גידול מפוזר יותר דורשים דיוק מוגבר. LCM הומצא אפוא בשנות ה-90 של המאה ה-20 והפך לדרך רבת ערך להסיר במדויק אזורים קטנים, מוגדרים ומיקרוסקופיים של רקמה משקופיות פרפין קבוע פורמלין (FFPE) 5,6,7,8. ניתן להשתמש ב-LCM כדי לאסוף אוכלוסיות של תאים בודדים כאשר ההטרוגניות המורכבת של הדגימה קיימת9 ומאפשרת איסוף של אוכלוסיות תאים שבעבר היה קשה להפריד. עם זאת, LCM דורש מכונות יקרות הדורשות מומחיות טכנית נרחבת וזמן מעשי 10,11,12,13,14.
המכשיר המשמש לניתוח אוטומטי של רקמות הוא בעל דיוק בין זה של LCM (~10 מיקרומטר) לבין מקרו-דיסקציות (~1 מ”מ)15. בנוסף, הוא מציג הן דרישות עלות והן דרישות מומחיות טכניות בין זו של מקרודיסקציה ו- LCM ונועד לבצע העשרת רקמות מהירה משקופיות FFPE רציפות כדי להקל על החסרונות של שיטות קודמות15. כריתה אוטומטית באופן זה משתמשת בביאורים דיגיטליים או בשכבות-על של תמונות ייחוס שקופיות על הבמה על גבי שקופיות רקמה לא מוכתמות בחתך סדרתי לצורך ניתוח והעשרה של אזורי עניין. המכשיר משתמש בקצות כרסום להב מסתובב מפלסטיק, צינורות איסוף של 1.5 מ”ל וניתן להשתמש בו עם מספר נוזלים שונים לצורך כריתה כדי לאסוף אזורי עניין לבדיקות במורד הזרם הכוללות מיצוי גרעין וריצוף. קצה הטחינה הפלסטי המסתובבת משתמש במאגרי חבית מזרקים פנימיים וחיצוניים ובוכנה לאיסוף חיץ, ואז טוחן ואוסף רקמות16. קוטר גודל קצה הטחינה המשתנה (250 מיקרומטר, 525 מיקרומטר, 725 מיקרומטר) יכול לאפשר כריתה של אזורי רקמה נפרדים לצורך השוואה, אזורים מולטיפוקליים שניתן לאגד או אזורים קטנים בודדים משקופיות FFPE בודדות או מרובות. ניתן להתאים את עוביי המקטעים המשמשים לקציר על סמך צרכי הניסוי האינדיבידואליים והמשתמשים יכולים להבטיח שאזורי העניין לא התרוקנו על ידי ביצוע H&E נוסף בקטע טורי אחד מיד לאחר הקטע האחרון ששימש לקציר.
כריתה אוטומטית זוהתה כדרך להעשיר את תכולת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה ובדקנו והרחבנו את הפונקציונליות המיועדת של מכשיר כריתת רקמות אוטומטי, המשווק כיום לשימוש בדגימות קליניות של FFPE בעובי של עד 10 מיקרומטר. העבודה מראה כי ניתן ליישם כריתה אוטומטית הן על FFPE והן על מקטעי רקמות קפואות טריות של בני אדם או בעלי חיים בעובי של עד 20 מיקרומטר למטרות מחקר. הפרוטוקול גם מדגים גישה לביאור דיגיטלי ולאוטומציה של כריתה להעשרת גידולים ברקמות עם תכולת גידול נמוכה ו/או מקרים של גידול מקונן ומפוזר שבו מקרו-דיסקציה משמעותית היא מאתגרת או לא אפשרית ומראה הן איכות והן תפוקה של חומצת גרעין המספיקה ל-NGS. לפיכך, דיסקציה אוטומטית יכולה לספק דיוק ברמה בינונית ותפוקה מוגברת להעשרת גידולים, וניתן ליישם אותה גם כדי להעשיר אזורי עניין אחרים או לשלב אותה עם פלטפורמות אחרות כדי לענות על שאלות מחקריות או קליניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מוצג כאן פרוטוקול ליישום של ביאור דיגיטלי וכריתה אוטומטית לנתח אזורי גידול מתכולת גידול נמוכה FFPE או רקמות קפואות טריות להעשרת הגידול והשימוש בו ב- WES. שילוב של ביאור דיגיטלי ויצירת מסכה עם דיסקציה אוטומטית מפחית באופן משמעותי את הזמן והמומחיות המעשיים הנדרשים הנפוצים בשיטות קלאסיות של הע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לקרמינה אספיריטו ורובין א. טיילור על תמיכתם בפיתוח דיסקציה אוטומטית, כמו גם לצוות המעבדה המרכזית לפתולוגיה של Genentech שתמך בעבודה זו.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center’s experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett’s Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
