Automatisiertes Dissektionsprotokoll zur Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt
Summary
Die digitale Annotation mit automatisierter Gewebedissektion bietet einen innovativen Ansatz zur Anreicherung von Tumoren in Fällen mit niedrigem Tumorgehalt und ist sowohl an Paraffin- als auch an gefrorene Gewebetypen anpassbar. Der beschriebene Workflow verbessert die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und den Durchsatz und kann sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Umgebung angewendet werden.
Abstract
Eine Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt, die je nach Methode unter 20% Tumorgehalt liegen, ist erforderlich, um Qualitätsdaten reproduzierbar mit vielen nachgelagerten Assays wie Next Generation Sequencing zu generieren. Die automatisierte Gewebedissektion ist eine neue Methodik, die die Tumoranreicherung in diesen häufigen Geweben mit niedrigem Tumorgehalt automatisiert und verbessert, indem sie die benutzerabhängige Ungenauigkeit der traditionellen Makrodissektion und die Zeit-, Kosten- und Fachkenntnissebeschränkungen der Laser-Capture-Mikrodissektion durch die Verwendung digitaler Bildannotationsüberlagerungen auf ungefärbten Objektträgern verringert. Hier werden digitale Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Annotationen verwendet, um kleine Tumorbereiche mit einer Klinge mit einem Durchmesser von250 μm 2 in ungefärbtem Formalin fixed paraffin embedded (FFPE) oder frischen gefrorenen Abschnitten mit einer Dicke von bis zu 20 μm für die automatisierte Tumoranreicherung vor der Nukleinsäureextraktion und der Sequenzierung ganzer Exome (WES) anzusprechen. Die automatisierte Dissektion kann annotierte Regionen in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt aus einzelnen oder mehreren Abschnitten für die Nukleinsäureextraktion ernten. Es ermöglicht auch die Erfassung umfangreicher Erfassungsmetriken vor und nach der Ernte bei gleichzeitiger Verbesserung der Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Erhöhung des Durchsatzes bei Auslastung von weniger Objektträgern. Das beschriebene Protokoll ermöglicht eine digitale Annotation mit automatisierter Dissektion von tierischem und/oder menschlichem FFPE oder frischem gefrorenem Gewebe mit niedrigem Tumorgehalt und könnte auch für jede Region von Interesse verwendet werden, um die Angemessenheit für nachgelagerte Sequenzierungsanwendungen in klinischen oder Forschungsabläufen zu erhöhen.
Introduction
Next Generation Sequencing (NGS) wird zunehmend sowohl für die Patientenversorgung als auch in der Krebsforschung eingesetzt, um Behandlungen zu leiten und wissenschaftliche Entdeckungen zu erleichtern. Das Gewebe ist oft begrenzt und kleine Proben mit variablem Tumorgehalt werden routinemäßig verwendet. Tumoradäquanz und -integrität bleiben daher ein Hindernis für die Gewinnung aussagekräftiger Daten. Proben mit niedrigeren Tumoranteilen können Schwierigkeiten bei der Unterscheidung von wahren Varianten von Sequenzierungsartefakten verursachen und sind oft nicht für NGS1 geeignet. Es hat sich gezeigt, dass die Tumoranreicherung von Fällen mit niedrigem Tumorgehalt, die unter 20% liegen, dazu beiträgt, ausreichend Material zu liefern, um reproduzierbare Sequenzierungsdaten zu generieren und sicherzustellen, dass niederfrequente Varianten nicht übersehen werden 2,3. Die Grenzen variieren jedoch je nach den verwendeten Plattformen und der geplanten Nutzung der generierten Daten.
Traditionell erfolgt die Anreicherung von Tumorregionen für die Extraktion durch manuelle Makrodissektion oder Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) von Formalin fixed paraffin embedded (FFPE) Objektträgern. Die manuelle Makrodissektion oder das Abkratzen bestimmter Gewebebereiche von Objektträgern ermöglicht die Entfernung von Tumorregionen für die Verwendung in nachgeschalteten Assays mit relativ geringen Kosten, aber mit geringer Genauigkeit und geringer Präzision 2,4. Minimale technische Genauigkeit kann sehr effektiv sein bei Fällen mit höherem Tumorgehalt, in denen große Tumorschwaden vorhanden sind und / oder minimaler Gewebeverlust die Ergebnisse nicht signifikant beeinflusst, aber Fälle mit niedrigem Tumorgehalt oder Fälle mit stärker dispergiertem Tumor erfordern eine erhöhte Präzision. LCM wurde daher in den 1990er Jahren erfunden und wurde zu einem wertvollen Weg, um kleine, definierte, mikroskopisch kleine Geweberegionen aus formalin fixen Paraffin eingebetteten (FFPE) Objektträgern 5,6,7,8 präzise zu entfernen. LCM kann verwendet werden, um Einzelzellpopulationen zu sammeln, wenn eine komplexe Heterogenität der Stichprobe besteht9, was die Sammlung von zuvor schwer zu trennenden Zellpopulationen ermöglicht. LCM erfordert jedoch kostspielige Maschinen, die umfangreiches technisches Know-how und praktische Zeit erfordern 10,11,12,13,14.
Das für die automatisierte Gewebedissektion verwendete Instrument weist eine Genauigkeit zwischen LCM (~10 μm) und Makrodissektionen (~1 mm)15 auf. Darüber hinaus weist es sowohl Kosten- als auch technische Qualifikationsanforderungen zwischen Makrodissektion und LCM auf und wurde entwickelt, um eine schnelle Gewebeanreicherung von sequentiellen FFPE-Objektträgern durchzuführen, um die Nachteile früherer Methodenzu lindern 15. Die automatisierte Dissektion auf diese Weise verwendet digitale Anmerkungen oder Referenzbildüberlagerungen auf der Bühne auf seriell geschnittene, ungefärbte Gewebeobjektträger, um Bereiche von Interesse zu sezieren und anzureichern. Das Instrument verwendet Kunststoff-Spinnmesser-Frässpitzen, 1,5-ml-Sammelrohre und kann mit einer Reihe verschiedener Flüssigkeiten zur Dissektion verwendet werden, um Bereiche zu sammeln, die für nachgeschaltete Assays von Interesse sind, einschließlich der Nukleinextraktion und -sequenzierung. Die sich drehende Kunststoff-Frässpitze verwendet innere und äußere Spritzenbehälter und einen Kolben, um Puffer zu sammeln, dann zu mahlen und sammelt Gewebe16. Der variable Durchmesser der Frässpitze (250 μm, 525 μm, 725 μm) kann die Dissektion von separaten Gewebebereichen zum Vergleich, multifokalen Regionen, die gepoolt werden können, oder einzelnen kleinen Bereichen aus einzelnen oder mehreren FFPE-Objektträgern ermöglichen. Die für die Ernte verwendeten Abschnittsdicken können basierend auf den individuellen Experimentanforderungen angepasst werden, und die Benutzer können sicherstellen, dass die interessierenden Regionen nicht erschöpft sind, indem sie unmittelbar nach dem letzten für die Ernte verwendeten Abschnitt eine zusätzliche H & E an einem seriellen Abschnitt durchführen.
Die automatisierte Dissektion wurde als eine Möglichkeit identifiziert, den Tumorgehalt in Fällen mit niedrigem Tumorgehalt anzureichern, und wir testeten und erweiterten die beabsichtigte Funktionalität eines automatisierten Gewebedissektionsinstruments, das derzeit für den Einsatz an klinischen FFPE-Proben mit einer Dicke von bis zu 10 μm vermarktet wird. Die Arbeit zeigt, dass die automatisierte Dissektion sowohl auf FFPE- als auch auf frisch gefrorene menschliche oder tierische Gewebeschnitte mit einer Dicke von bis zu 20 μm für Forschungszwecke angewendet werden kann. Das Protokoll demonstriert auch einen Ansatz zur digitalen Annotation und Automatisierung der Dissektion für die Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt und / oder Fällen mit verschachtelten, dispergierten Tumoren, bei denen eine sinnvolle Makrodissektion eine Herausforderung darstellt oder nicht durchführbar ist, und zeigt sowohl die Qualität als auch die Ausbeute an Nukleinsäuren, die für NGS ausreichen. Die automatisierte Dissektion kann daher eine mittlere Präzision und einen erhöhten Durchsatz für die Tumoranreicherung bieten und könnte auch zur Bereicherung anderer interessanter Regionen oder in Kombination mit anderen Plattformen zur Beantwortung von Forschungs- oder klinischen Fragen eingesetzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird ein Protokoll für die Anwendung von digitaler Annotation und automatisierter Dissektion vorgestellt, um Tumorregionen von FFPE mit niedrigem Tumorgehalt oder frischem gefrorenem Gewebe für die Tumoranreicherung und den Einsatz in WES zu sezieren. Die Kombination von digitaler Annotation und Maskenerstellung mit automatisierter Dissektion reduziert die erforderliche praktische Zeit und das Know-how, die für klassische Methoden der Tumoranreicherung, einschließlich manueller Makrodissektion und LCM, üblich s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Carmina Espiritu und Robin E. Taylor für ihre Unterstützung bei der Entwicklung automatisierter Dissektionen sowie den Mitarbeitern des Genentech Pathology Core Laboratory, die diese Arbeit unterstützt haben.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center’s experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett’s Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
