Summary
Цифровая аннотация с автоматизированным рассечением тканей обеспечивает инновационный подход к обогащению опухоли в случаях с низким содержанием опухоли и адаптируется как к парафиновым, так и к замороженным типам тканей. Описанный рабочий процесс повышает точность, воспроизводимость и пропускную способность и может применяться как к исследованиям, так и к клиническим условиям.
Abstract
Обогащение опухоли в тканях с низким содержанием опухоли, которые ниже 20% содержания опухоли в зависимости от метода, требуется для воспроизводимой генерации качественных данных со многими последующими анализами, такими как секвенирование следующего поколения. Автоматизированная рассечение тканей - это новая методология, которая автоматизирует и улучшает обогащение опухоли в этих распространенных тканях с низким содержанием опухоли за счет уменьшения зависящей от пользователя неточности традиционной макродиссекции и ограничений времени, стоимости и опыта микродиссекции лазерного захвата с использованием наложения аннотаций цифрового изображения на незапятнанные слайды. Здесь цифровые аннотации гематоксилина и эозина (H & E) используются для нацеливания на небольшие области опухоли с использованием лезвия диаметром 250 мкм2 в неокрашенном фиксированном парафине формалина (FFPE) или свежезамороженных участках толщиной до 20 мкм для автоматизированного обогащения опухоли до экстракции нуклеиновых кислот и секвенирования всего экзома (WES). Автоматизированное рассечение может собирать аннотированные области в тканях с низким содержанием опухоли из одного или нескольких секций для экстракции нуклеиновых кислот. Он также позволяет собирать обширные метрики сбора до и после сбора урожая, одновременно повышая точность, воспроизводимость и увеличивая пропускную способность с использованием меньшего количества слайдов. Описанный протокол обеспечивает цифровую аннотацию с автоматическим рассечением на животных и/или человеческих FFPE или свежезамороженных тканях с низким содержанием опухоли, а также может быть использован для обогащения любой интересующей области для повышения адекватности для последующих приложений секвенирования в клинических или исследовательских рабочих процессах.
Introduction
Секвенирование следующего поколения (NGS) все чаще используется как для ухода за пациентами, так и для исследований рака, чтобы помочь в руководстве лечением и облегчить научные открытия. Ткань часто ограничена, и обычно используются небольшие образцы с переменным содержанием опухоли. Таким образом, адекватность и целостность опухоли остаются препятствием для получения значимых данных. Образцы с более низким процентом опухоли могут вызвать трудности в различении истинных вариантов от артефактов секвенирования и часто не имеют права на NGS1. Было показано, что обогащение опухоли в случаях с низким содержанием опухоли, ниже 20%, помогает получить достаточное количество материала для получения воспроизводимых данных секвенирования и обеспечения того, чтобы низкочастотные варианты не были пропущены 2,3. Однако ограничения будут варьироваться в зависимости от используемых платформ и планируемого использования генерируемых данных.
Традиционно обогащение опухолевых областей для экстракции выполняется ручной макродиссекцией или лазерной микродиссекцией захвата (LCM) формалиновых фиксированных парафиновых встроенных (FFPE) слайдов. Ручная макродиссекция или соскоб определенных участков тканей со слайдов позволяет удалять опухолевые области для использования в последующих анализах с относительно низкой стоимостью, но с низкой точностью и низкой точностью 2,4. Минимальная техническая точность может быть очень эффективной в случаях с более высоким содержанием опухоли, когда присутствуют большие участки опухоли и / или минимальная потеря ткани существенно не влияет на результаты, но случаи с низким содержанием опухоли или случаи с более дисперсной опухолью требуют повышенной точности. Поэтому LCM был изобретен в 1990-х годах и стал ценным способом точного удаления небольших, определенных, микроскопических областей ткани из формалиновых фиксированных парафиновых встроенных (FFPE) слайдов 5,6,7,8. LCM может быть использован для сбора одиночных клеточных популяций, когда существует сложная гетерогенность образца9, позволяющая собирать ранее трудно разделяемые клеточные популяции. Тем не менее, LCM требует дорогостоящего оборудования, которое требует обширных технических знаний и практического времени 10,11,12,13,14.
Инструмент, используемый для автоматизированного рассечения тканей, имеет точность между LCM (~ 10 мкм) и макродиссекции (~ 1 мм) 15. Кроме того, он демонстрирует как затратные, так и технические требования к экспертизе между макродиссекцией и LCM и предназначен для выполнения быстрого обогащения тканей последовательными слайдами FFPE для смягчения недостатков предыдущих методов15. Автоматизированное рассечение таким образом использует цифровые аннотации или накладки эталонных изображений слайдов на сцене на последовательно секционированные неокрашенные тканевые слайды для рассечения и обогащения областей, представляющих интерес. Инструмент использует пластиковые наконечники для фрезерования прядильных лезвий, коллекторные трубки объемом 1,5 мл и может использоваться с рядом различных жидкостей для рассечения для сбора областей, представляющих интерес для последующих анализов, включая нуклеиновую экстракцию и секвенирование. Вращающийся пластиковый фрезерный наконечник использует внутренние и внешние резервуары для шприцевых бочек и плунжер для сбора буфера, а затем фрезерует и собирает ткань16. Переменный диаметр фрезерного наконечника (250 мкм, 525 мкм, 725 мкм) может позволить рассечение отдельных областей ткани для сравнения, мультифокальных областей, которые могут быть объединены, или отдельных небольших областей из одного или нескольких слайдов FFPE. Толщина секций, используемых для сбора урожая, может быть скорректирована на основе индивидуальных потребностей эксперимента, и пользователи могут гарантировать, что интересующие регионы не были исчерпаны, выполнив дополнительный H &E на одной последовательной секции сразу после последней секции, используемой для сбора урожая.
Автоматизированное рассечение было идентифицировано как способ обогащения опухолевого содержания в случаях с низким содержанием опухоли, и мы протестировали и расширили предполагаемую функциональность автоматизированного инструмента для рассечения тканей, который в настоящее время продается для использования на клинических образцах FFPE толщиной до 10 мкм. Работа показывает, что автоматизированное рассечение может быть применено как к FFPE, так и к свежезамороженным участкам тканей человека или животных толщиной до 20 мкм в исследовательских целях. Протокол также демонстрирует подход к цифровому аннотированию и автоматизации рассечения для обогащения опухоли в тканях с низким содержанием опухоли и / или случаях с вложенной, дисперсной опухолью, где значимая макродиссекция является сложной или неосуществимой, и показывают как качество, так и выход нуклеиновой кислоты, достаточные для NGS. Таким образом, автоматизированная рассечение может обеспечить точность среднего уровня и повышенную пропускную способность для обогащения опухоли, а также может применяться для обогащения других областей, представляющих интерес, или в сочетании с другими платформами для ответа на исследовательские или клинические вопросы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
До начала получите соответствующие образцы тканей в соответствии с протоколами Институционального наблюдательного совета (IRB). Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Genentech, Inc.
1. Подготовка тканей и слайдов
- Выберите FFPE или свежезамороженные тканевые блоки и используйте соответствующий метод обработки ниже.
- Нарежьте участки тканевого блока на положительно заряженных стеклянных слайдах нужной толщины. Последовательное сечение ткани FFPE в лентах с первым эталонным сечением разрезается на толщину, подходящую для окрашивания H&E (т.е. 4 мкм), затем 1-4 секции толщиной от 4-20 мкм в зависимости от потребности и доступности ткани. Соберите участки ткани на положительно заряженные стеклянные стекла микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежезамороженные срезы эталонных тканей должны быть немедленно окрашены гематоксилином и эозином (H & E) с использованием обычных протоколов для замороженных секций, а незапятнанные замороженные участки должны храниться при -20 ° C до тех пор, пока они не понадобятся для сбора урожая. - Дайте всем секциям FFPE высохнуть при комнатной температуре в течение ночи.
- Выпекайте эталонные слайды FFPE при 60 °C в течение 30 минут, а затем окрашивайте их с помощью H&E, используя обычные протоколы.
- Сканируйте окрашенные H&E слайды на цельном слайд-тепловизоре с 20-кратным увеличением или выше.
- Аннотируйте отсканированные изображения слайдов для интересующих опухолевых областей с помощью предоставленной поставщиком платформы просмотра или средства просмотра с открытым исходным кодом. Экспортируйте эти аннотации в виде снимка экрана с малым увеличением или сохраните их в виде файла метаданных, содержащего координаты пикселей X-Y, соответствующие вершинам многоугольников.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первый менее технически сложен в работе, но последний предлагает преимущества в автоматизации процессов. - Создавайте цифровые маски интересующих аннотированных областей в соответствии с используемым подходом и экспортируйте ручные аннотации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется скриншот / изображение аннотаций, простое программное обеспечение для обработки изображений может быть использовано для выбора области и заполнения всего выделения. Использование координат X-Y для каждой окупаемости инвестиций требует использования языка программирования для чтения как данных изображения, так и полигональных координат для создания изображения с низким mag с заполненными областями, представляющими интерес. Пользователь должен работать с поставщиком автоматизированного инструмента для вскрытия, чтобы установить процесс, основанный на его индивидуальной доступности программного обеспечения и потребностях. Если сканирование, цифровая аннотация слайдов и/или создание цифровой маски недоступны, можно выполнить тщательную аннотацию на слайде с использованием маркера и использовать ее вместо цифровой маски в качестве эталонного изображения. Псевдокод для создания цифровой маски приведен в Дополнительном файле 1.
2. Автоматизированное рассечение тканей
- Поместите незапятнанные слайды образца ткани на сцену в первом-четвертом положениях слайдов при использовании цифровой ссылки на слайд. При использовании аннотации на слайде, а не цифрового варианта, поместите незапятнанные образцы тканей на сцену во втором-четвертом положениях слайда с эталонным слайдом в первой позиции.
- Создайте задание фрезерования с помощью автоматизированного программного обеспечения для рассечения тканей: Выбор задания > Создание нового задания > Идентификатор случая > Назовите задание фрезерования; перейдите в раздел Толщина > Толщина сечения с помощью вкладки стрелки вверх или вниз; затем перейдите в раздел Подготовка тканей > Парафинизированный или депарафинизированный, Эталонное изображение > Из файла > Импорт изображения > Файл для импорта из раскрывающегося списка в качестве цифровой ссылки, если это применимо. Выберите «Из рабочей области» для ссылки на слайд сцены. Когда поля будут заполнены, отсканируйте рабочую область, нажав кнопку «Область сканирования» в правом нижнем углу, чтобы захватить каждый слайд образца ткани в первой-четвертой позиции.
- Выберите область ткани для захвата изображения.
- При использовании ссылки на рабочую область перетащите поле из одного угла в противоположный, чтобы создать прямоугольную область поверх ткани. Выделите круговой пузырь под прямоугольной областью, чтобы захватить эталонное изображение рабочей области. При использовании цифрового эталонного изображения наложите изображение на выбранную прямоугольную область. Значительно измените размер и выровняйте цифровую ссылку в ходе масштабирования, чтобы наилучшим образом соответствовать размеру и положению над тканью образца.
- Скопируйте это прямоугольное поле на оставшиеся слайды образца ткани во втором-четвертом положениях слайда, выбрав параметр копирования в правом верхнем углу эталонного изображения. Выровняйте и изменяйте размер по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании эталонного изображения на слайде, а не цифровой маски, выберите, какой слайд в рабочей области следует использовать в качестве эталона.
- Выравнивание ссылочных и образцовых слайдов
- Когда эталонное изображение будет сильно выровнено на слайдах образца ткани во всех положениях слайдов, нажмите кнопку «Область сканирования» в правом нижнем углу экрана, чтобы перейти к шагу тонкой настройки. Выберите положение первого этапа и значок инструмента «Трансформирование» (третий значок вниз на панели инструментов справа), чтобы выполнить точное выравнивание и корректировку масштаба ссылки в соответствии с примером наложения слайдов. Используйте скользящую панель «Ссылка на образец» в нижней части экрана, переключаясь между эталонным изображением и образцом изображения, а также функцию «Увеличить масштаб» и «Уменьшить масштаб» для настройки и выравнивания каждого положения слайда. Воспроизведите этот процесс во втором-четвертом образцах слайдов.
- Выберите область фрезерования интересующего региона
- После достижения оптимального наложения образца каждой из четырех позиций слайда нарисуйте обозначения контуров фрезерования с помощью значка инструмента «Палитра цветов» (десятый значок внизу на правой панели инструментов) на цветной части маскированного эталонного изображения. Установите флажок Расширить до аналогичного, если несколько слайдов или областей аннотированы для рассечения, а затем нажмите кнопку «Получить аннотации» в правом нижнем углу, чтобы нарисовать контуры фрезерования на образцах слайдов.
- Выберите контур фрезерования в первом положении слайда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда путь фрезерования выбран в первом положении слайда, он будет скопирован на остальные позиции слайда и будет рассчитано использование фрезерного наконечника. Использование фрезерного наконечника в левом верхнем углу рассчитывается на основе площади покрытия и выбранного размера наконечника. Если рассчитано более четырех подсказок, можно выбрать больший размер наконечника для получения аннотированной окупаемости инвестиций. Размер наконечника можно выбрать или изменить в левой части экрана под стрелкой Фрезерный наконечник , и использование наконечника будет пересчитано. - Когда рассчитан путь фрезерования, соберите аннотированную рентабельность инвестиций с помощью четырех или менее фрезерных наконечников. Нажмите кнопку Setup Stage в правом нижнем углу экрана, чтобы запросить загрузку фрезерных наконечников из размещенных коллекторных трубок в их надлежащем обозначении на сцене.
- Заполните резервуар 3,0 мл буфера рассечения, наиболее подходящего для типа ткани (FFPE или свежезамороженного) и последующего набора для экстракции нуклеиновых кислот, и нажмите кнопку Dissect в правом нижнем углу экрана. Используйте минеральное масло молекулярного класса или соответствующий буфер из коммерчески доступных наборов для экстракции нуклеиновых кислот.
ПРИМЕЧАНИЕ: Затем начинается автоматическое рассечение слайдов и выбранных областей, представляющих интерес, и образцы собираются прибором. Головка блока будет подбирать фрезерные наконечники с задней части ступени и заполняться рассеченной жидкостью из резервуара. Затем наконечники вращаются вдоль пути фрезерования, аспирируя образец ткани с слайдов до полного или полного заполнения. Собранный образец с диссекционной жидкостью затем дозируется в сборные пробирки, расположенные в задней части стадии. - Когда автоматическое рассечение будет завершено, извлеките из сцены сборные трубки и рассеченные слайды образцов и поместите их в стойку для трубок и скользящую стойку соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежезамороженные урожаи должны быть взяты непосредственно в экстракцию нуклеиновых кислот в соответствии с инструкциями производителя, а свежезамороженные секции после вскрытия должны быть немедленно окрашены H &E с использованием обычных протоколов для замороженных секций. - Выпекайте предметные стекла при температуре 60 °C в течение 30 минут, а затем окрашивайте их с помощью H&E, используя обычные протоколы.
- Отсканируйте рассеченные H&E окрашенные слайды на целый слайд-изображатель с 20-кратным увеличением и / или архив для справки о том, какая ткань не была собрана и остается на слайде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные варианты сканирования см. на шаге 1.5 выше.
3. Экстракция нуклеиновых кислот
- Пул и гранулирование ткани. Выполните экстракцию нуклеиновых кислот с помощью коммерчески доступного комплекта и следуя инструкциям производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Были отобраны участки печени мышей FFPE и FF, содержащие метастатический колоректальный рак в ксенотрансплантатах. Участки были окрашены H&E (рисунок 1A, E, I) и отсканированы на целом слайд-тепловизоре с 20-кратным увеличением. Патологоанатом цифрово аннотировал интересующие опухолевые области и маску, которая была сгенерирована с использованием коммерческого программного обеспечения и отформатирована как цифровое эталонное изображение png (рисунок 1B, F, J). Серийные неокрашенные слайды образца толщиной 10 мкм и толщиной 20 мкм были помещены на сцену и выполнено автоматическое рассечение, как описано выше. Свежезамороженные ткани собирали в буфер лизиса из коммерчески доступного набора и переносили непосредственно в экстракцию нуклеиновых кислот в соответствии с инструкциями производителя. Образцы FFPE были собраны с использованием минерального масла молекулярного класса, а рассеченные образцы были объединены вместе и центрифугированы при 25 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Супернатант удаляли, а минимально необходимое минеральное масло использовали для повторного суспендирования, переноса и сбора рассеченной ткани в одну сборную пробирку для каждого образца соответствующим образом. Образцы были отправлены при комнатной температуре поставщику для экстракции нуклеиновых кислот, определения размеров РНК и ДНК, количества, целостности и чистоты в соответствии с инструкциями производителя. Библиотеки секвенирования были созданы и использованы для гибридизации и захвата с коммерческими опциями в соответствии с инструкциями производителя. После рассеченного образца слайды были окрашены H & E с использованием обычных протоколов окрашивания для подтверждения того, что области рассечения в 10 мкм (рисунок 1C, G, K) и 20 мкм (рисунок 1D, H, L) слайды и метрики рассечения были захвачены (дополнительная таблица 1). Секвенирование экзома генерировало приблизительно 75 миллионов парных считываний 100 бит/с, что дало среднюю глубину покрытия (до удаления дублирующих считываний) 150x на выборку, при этом 99,9% считываний выровнено и 78% по целевому показателю. Метрики секвенирования РНК продемонстрировали чуть более 55 миллионов парных считываний bp, скорость выравнивания 98% и частоту дублирования 19,4% с 77% конкордантных показаний.
Рисунок 1; Успешное рассечение опухолевых гнезд из свежезамороженной и FFPE ткани. H&E окрашенная мышью свежезамороженная (A-D) и FFPE (E-L) ткань печени с метастазированием колоректального рака. Эталонные слайды размером 4 мкм, используемые для цифровой аннотации (A, E, I), демонстрируют примеры с низким процентом опухоли для общей площади ткани (I) и распределенных опухолевых гнезд (E), которые классически представляют проблемы для обогащения опухоли. Были сгенерированы аннотированные и замаскированные в цифровом виде эталонные слайды H&E (B, F, J), а окрашенные слайды H&E после вскрытия 10 мкм (C, G, K) и 20 мкм (D, H,L) H&E демонстрируют успешный сбор урожая в выбранных районах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Псевдокод, используемый для создания цифровых масок из аннотаций для использования в автоматическом вскрытии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Пример захваченных метрик из автоматической диссекции и экстракции нуклеиновых кислот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлен протокол применения цифровой аннотации и автоматизированного рассечения для рассечения опухолевых областей от низкоопухолевых FFPE или свежезамороженных тканей для обогащения опухоли и использования в WES. Сочетание цифровой аннотации и создания маски с автоматизированным вскрытием значительно сокращает требуемое практическое время и опыт, общие для классических методов обогащения опухоли, включая ручную макродиссекции и LCM. Протокол демонстрирует потенциально важный вариант обогащения опухоли среднего уровня, который позволяет не только обогащать низкое содержание опухоли, но и обогащение в случаях, когда трудно рассечь распределенные опухолевые гнезда от соседней с опухолью нормальной ткани для значимого обогащения опухоли с высокой пропускной способностью и умеренным уровнем точности. Хотя использование нашего рабочего процесса для тканей ксенотрансплантата с низким содержанием опухоли демонстрируется здесь, также было обнаружено, что этот протокол работает между типами тканей, включая ткани человека, мышей и ксенотрансплантата для различных нормальных тканей и показаний к раку.
Таким образом, он может также применяться к широкому кругу применений, где обогащение для конкретных областей, представляющих интерес, без значительного загрязнения фоновой ткани было бы полезным (т. Е. Обогащение для определенной области мозга) или даже для удаления областей ткани до экстракции нуклеиновых кислот с использованием классической макродиссекции.
На рынке существует множество платформ для сканирования слайдов и цифровой аннотации. Поэтому важно помнить, что совместимость платформ может представлять ограничения, а определенные платформы в рамках любого протокола могут быть широко доступны не во всех лабораториях. Поэтому были предприняты значительные усилия по предоставлению альтернативных вариантов в рамках описанного протокола, которые будут направлять пользователей при внесении любых необходимых изменений на основе имеющихся у них ресурсов. Также была отмечена возможность удаления компонента цифровой аннотации, позволяющая тщательно выполнять рукописную аннотацию на слайде. Опции, предоставляемые для модификаций, максимизируют способность пользователей найти вариант, который работает с их текущей платформой и доступностью программного обеспечения.
Хотя было продемонстрировано, что цифровая аннотация и автоматизированное рассечение широко применяются как к FFPE, так и к свежезамороженной ткани, важно отметить, что границы автоматизированного инструмента для рассечения тканей были выдвинуты за пределы его предполагаемого использования с образцами FFPE, и протокол предназначен только для исследовательского использования. Здесь успешное обогащение опухоли было продемонстрировано с помощью автоматизированного рассечения опухоли с низким содержанием опухоли FFPE, а также свежезамороженных тканей для экстракции нуклеиновых кислот, WES и секвенирования РНК. Протокол показывает, что интересующие ксенотрансплантат и области тканей человека могут быть обогащены до секвенирования WES и РНК в условиях фундаментальных и трансляционных исследований, а также отмечают, что возможны другие последующие молекулярные приложения, включая ПЦР, из обоих типов тканей. Протокол расширяет возможности автоматизированного рассечения FFPE и закладывает основу для автоматизированного вскрытия свежезамороженных тканей, которое может быть разработано и проверено для использования в клинических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Чарльз А. Хавнар, Оливер Зилл, Джефф Истхэм, Джеффри Хунг, Дженнифер Гилтнан, Николас Лоунсбери, Даниэль Орепер, Сараджан Сатурнио и Эми А Ло являются сотрудниками и акционерами Genentech и Roche, а Мана Джави и Эммануэль Наури являются сотрудниками и акционерами Roche.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Кармину Эспириту и Робина Э. Тейлора за их поддержку в разработке автоматизированного вскрытия, а также сотрудников Genentech Pathology Core Laboratory, которые поддержали эту работу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al.
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
