कम ट्यूमर सामग्री ऊतकों में ट्यूमर संवर्धन के लिए स्वचालित विच्छेदन प्रोटोकॉल
Summary
स्वचालित ऊतक विच्छेदन के साथ डिजिटल एनोटेशन कम ट्यूमर सामग्री के मामलों में ट्यूमर को समृद्ध करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण प्रदान करता है और पैराफिन और जमे हुए ऊतक प्रकार दोनों के लिए अनुकूल है। वर्णित वर्कफ़्लो सटीकता, प्रजनन क्षमता और थ्रूपुट में सुधार करता है और इसे अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स दोनों पर लागू किया जा सकता है।
Abstract
कम ट्यूमर सामग्री ऊतकों में ट्यूमर संवर्धन, विधि के आधार पर 20% ट्यूमर सामग्री से नीचे, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जैसे कई डाउनस्ट्रीम परखों के साथ गुणवत्ता डेटा उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है। स्वचालित ऊतक विच्छेदन एक नई पद्धति है जो पारंपरिक मैक्रो-विच्छेदन और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के समय, लागत और विशेषज्ञता सीमाओं के उपयोगकर्ता-निर्भर अशुद्धता को कम करके इन सामान्य, कम ट्यूमर सामग्री ऊतकों में ट्यूमर संवर्धन को स्वचालित और सुधारती है। यहां, डिजिटल हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) एनोटेशन का उपयोग ब्लेड का उपयोग करके छोटे ट्यूमर क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए किया जाता है जो न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और पूरे एक्सोम अनुक्रमण (डब्ल्यूईएस) से पहले स्वचालित ट्यूमर संवर्धन के लिए मोटाई में 20 μm तक बिना दाग वाले फॉर्मलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) या ताजा जमे हुए वर्गों में 250 μm 2 व्यास है। स्वचालित विच्छेदन न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए एकल या कई वर्गों से कम ट्यूमर सामग्री ऊतकों में एनोटेट क्षेत्रों की कटाई कर सकते हैं। यह सटीकता, प्रजनन क्षमता में सुधार करते हुए और कम स्लाइड के उपयोग के साथ थ्रूपुट में वृद्धि करते हुए व्यापक पूर्व और बाद के फसल संग्रह मैट्रिक्स पर कब्जा करने की भी अनुमति देता है। वर्णित प्रोटोकॉल पशु और / या मानव एफएफपीई या कम ट्यूमर सामग्री के साथ ताजा जमे हुए ऊतकों पर स्वचालित विच्छेदन के साथ डिजिटल एनोटेशन को सक्षम बनाता है और नैदानिक या अनुसंधान वर्कफ़्लो में डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्तता को बढ़ावा देने के लिए ब्याज संवर्धन के किसी भी क्षेत्र के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) का उपयोग रोगी देखभाल और कैंसर अनुसंधान दोनों के लिए तेजी से किया जाता है ताकि उपचार का मार्गदर्शन करने और वैज्ञानिक खोज को सुविधाजनक बनाने में मदद मिल सके। ऊतक अक्सर सीमित होता है और चर ट्यूमर सामग्री वाले छोटे नमूने नियमित रूप से उपयोग किए जाते हैं। ट्यूमर पर्याप्तता और अखंडता, इसलिए, सार्थक डेटा प्राप्त करने के लिए एक बाधा बनी हुई है। कम ट्यूमर प्रतिशत वाले नमूने अनुक्रमण कलाकृतियों से सच्चे वेरिएंट को अलग करने में कठिनाई पैदा कर सकते हैं और अक्सर एनजीएस1 के लिए अयोग्य होते हैं। कम ट्यूमर सामग्री के मामलों के ट्यूमर संवर्धन, 20% से नीचे, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अनुक्रमण डेटा उत्पन्न करने और यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त सामग्री उपज में मदद करने के लिए दिखाया गया है कि कम आवृत्ति वेरिएंट 2,3 से चूक न जाएं। हालांकि, उपयोग किए गए प्लेटफार्मों और उत्पन्न डेटा के नियोजित उपयोग के आधार पर सीमाएं अलग-अलग होंगी।
परंपरागत रूप से, निष्कर्षण के लिए ट्यूमर क्षेत्रों का संवर्धन फॉर्मलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) स्लाइड के मैनुअल मैक्रोडिसेक्शन या लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) द्वारा किया जाता है। मैनुअल मैक्रोडिसेक्शन, या स्लाइड से निर्दिष्ट ऊतक क्षेत्रों को स्क्रैप करना, ट्यूमर क्षेत्रों को अपेक्षाकृत कम लागत के साथ डाउनस्ट्रीम परख में उपयोग के लिए हटाने की अनुमति देता है, लेकिन कम सटीकता और कम परिशुद्धता 2,4 के साथ। न्यूनतम तकनीकी सटीकता उच्च ट्यूमर सामग्री के मामलों के साथ बहुत प्रभावी हो सकती है जहां ट्यूमर के बड़े स्वैथ मौजूद हैं और / या न्यूनतम ऊतक हानि परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करती है, लेकिन कम ट्यूमर सामग्री के मामलों या अधिक बिखरे हुए ट्यूमर वाले मामलों में वृद्धि की सटीकता की आवश्यकता होती है। इसलिए एलसीएम का आविष्कार 1990 के दशक में किया गया था और फॉर्मलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) स्लाइड 5,6,7,8 से ऊतकके छोटे, परिभाषित, सूक्ष्म क्षेत्रों को ठीक से हटाने का एक मूल्यवान तरीका बन गया। एलसीएम का उपयोग एकल सेल आबादी एकत्र करने के लिए किया जा सकता है जब नमूने की जटिल विषमता मौजूद होती है9 सेल आबादी को अलग करने के लिए पहले मुश्किल के संग्रह की अनुमति देता है। हालांकि, एलसीएम को महंगी मशीनरी की आवश्यकता होती है जिसके लिए व्यापक तकनीकी विशेषज्ञता और हाथों पर 10,11,12,13,14 की आवश्यकता होती है।
स्वचालित ऊतक विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण में एलसीएम (~ 10 μm) और मैक्रोडिसेक्शन (~ 1 मिमी) 15 के बीच परिशुद्धता होती है। इसके अतिरिक्त, यह मैक्रोडिसेक्शन और एलसीएम के बीच लागत और तकनीकी विशेषज्ञता आवश्यकताओं दोनों को प्रदर्शित करता है और पिछले तरीकों के नुकसान को कम करने के लिए अनुक्रमिक एफएफपीई स्लाइड से तेजी से ऊतक संवर्धन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है15. इस फैशन में स्वचालित विच्छेदन डिजिटल एनोटेशन या ऑन-स्टेज स्लाइड संदर्भ छवि ओवरले का उपयोग करता है जो ब्याज के विदारक और समृद्ध क्षेत्रों के लिए क्रमिक रूप से खंडित बिना दाग वाले ऊतक स्लाइड पर होता है। उपकरण प्लास्टिक कताई ब्लेड मिलिंग युक्तियों, 1.5 एमएल संग्रह ट्यूबों का उपयोग करता है और न्यूक्लिक निष्कर्षण और अनुक्रमण सहित डाउनस्ट्रीम परख के लिए ब्याज के क्षेत्रों को इकट्ठा करने के लिए विच्छेदन के लिए विभिन्न तरल पदार्थों की एक संख्या के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। कताई प्लास्टिक मिलिंग टिप आंतरिक और बाहरी सिरिंज बैरल जलाशयों और बफर इकट्ठा करने के लिए एक सवार का उपयोग करता है, फिर मिलों और ऊतक16 एकत्र करता है। चर मिलिंग टिप आकार व्यास (250 μm, 525 μm, 725 μm) तुलना के लिए अलग ऊतक क्षेत्रों के विच्छेदन के लिए अनुमति दे सकते हैं, मल्टीफोकल क्षेत्रों है कि पूल या एकल या एकाधिक एफएफपीई स्लाइड से अलग छोटे क्षेत्रों. फसल के लिए उपयोग की जाने वाली अनुभाग मोटाई को व्यक्तिगत प्रयोग आवश्यकताओं के आधार पर समायोजित किया जा सकता है और उपयोगकर्ता यह सुनिश्चित कर सकते हैं कि फसल के लिए उपयोग किए जाने वाले अंतिम खंड के तुरंत बाद एक धारावाहिक अनुभाग पर एक अतिरिक्त एच एंड ई प्रदर्शन करके ब्याज के क्षेत्रों को समाप्त नहीं किया गया है।
स्वचालित विच्छेदन को कम ट्यूमर सामग्री के मामलों में ट्यूमर सामग्री को समृद्ध करने के तरीके के रूप में पहचाना गया था और हमने एक स्वचालित ऊतक विच्छेदन उपकरण की इच्छित कार्यक्षमता का परीक्षण और विस्तार किया, जिसे वर्तमान में मोटाई में 10 μm तक एफएफपीई नैदानिक नमूनों पर उपयोग के लिए विपणन किया जाता है। काम से पता चलता है कि स्वचालित विच्छेदन अनुसंधान प्रयोजनों के लिए मोटाई में 20 μm तक एफएफपीई और ताजा जमे हुए मानव या पशु ऊतक वर्गों दोनों पर लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल कम ट्यूमर सामग्री वाले ऊतकों में ट्यूमर संवर्धन के लिए डिजिटल रूप से एनोटेट और स्वचालित विच्छेदन के लिए एक दृष्टिकोण भी प्रदर्शित करता है और / या नेस्टेड, बिखरे हुए ट्यूमर के साथ मामलों में जहां सार्थक मैक्रोडिसेक्शन चुनौतीपूर्ण है या संभव नहीं है और एनजीएस के लिए पर्याप्त न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता और उपज दोनों दिखाता है। स्वचालित विच्छेदन इसलिए ट्यूमर संवर्धन के लिए मध्य-स्तरीय परिशुद्धता और बढ़े हुए थ्रूपुट प्रदान कर सकता है और ब्याज के अन्य क्षेत्रों को समृद्ध करने या अनुसंधान या नैदानिक प्रश्नों के उत्तर देने के लिए अन्य प्लेटफार्मों के साथ संयुक्त करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत कम ट्यूमर सामग्री एफएफपीई या ट्यूमर संवर्धन और डब्ल्यूईएस में उपयोग के लिए ताजा जमे हुए ऊतकों से ट्यूमर क्षेत्रों को विच्छेदन करने के लिए डिजिटल एनोटेशन और स्वचालित विच्छेदन के आवेदन क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक स्वचालित विच्छेदन विकास में उनके समर्थन के साथ-साथ जेनेंटेक पैथोलॉजी कोर प्रयोगशाला कर्मचारियों के लिए कार्मिना एस्पिरिटू और रॉबिन ई टेलर को धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने इस काम का समर्थन किया।
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
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