낮은 종양 함량 조직에서 종양 농축을 위한 자동화된 해부 프로토콜
Summary
자동화된 조직 해부를 통한 디지털 주석은 낮은 종양 함량의 경우에 종양을 농축하는 혁신적인 접근 방식을 제공하며 파라핀 및 냉동 조직 유형 모두에 적응할 수 있습니다. 설명 된 워크 플로는 정확성, 재현성 및 처리량을 향상 시키며 연구 및 임상 설정 모두에 적용될 수 있습니다.
Abstract
낮은 종양 함량 조직에서의 종양 농축은, 방법에 따라 종양 함량이 20% 미만인 조직에서, 차세대 시퀀싱과 같은 많은 다운스트림 분석으로 재현가능하게 양질의 데이터를 생성하기 위해 요구된다. 자동화된 조직 해부(Automated tissue dissection)는 염색되지 않은 슬라이드에 디지털 이미지 주석 오버레이를 사용하여 기존의 매크로 해부 및 시간, 비용 및 전문 지식의 한계를 줄임으로써 이러한 일반적인, 낮은 종양 함량의 조직에서 종양 농축을 자동화하고 개선하는 새로운 방법론입니다. 여기서, 디지털 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 주석은 염색되지 않은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE)에서 직경250μm2 인 블레이드 또는 핵산 추출 및 전체 엑소메 시퀀싱(WES) 전에 자동화된 종양 농축을 위해 두께가 최대 20μm인 신선한 냉동 절편을 사용하여 작은 종양 영역을 표적으로 하는 데 사용됩니다. 자동화된 해부는 핵산 추출을 위해 단일 또는 다중 절편으로부터 낮은 종양 함량 조직에서 주석이 달린 영역을 수확할 수 있다. 또한 광범위한 수확 전후 수집 메트릭을 캡처하는 동시에 정확성, 재현성을 향상시키고 슬라이드를 더 적게 활용하여 처리량을 높일 수 있습니다. 기술된 프로토콜은 종양 함량이 낮은 동물 및/또는 인간 FFPE 또는 신선한 냉동 조직에 대한 자동화된 해부와 함께 디지털 주석을 가능하게 하며, 또한 임상 또는 연구 워크플로우에서 다운스트림 시퀀싱 애플리케이션에 대한 적절성을 높이기 위해 관심 영역 농축에 사용될 수 있다.
Introduction
차세대 염기서열 분석(NGS)은 환자 치료와 암 연구 모두에 점점 더 많이 활용되어 치료를 안내하고 과학적 발견을 촉진합니다. 조직은 종종 제한적이며 가변 종양 함량을 가진 작은 표본이 일상적으로 사용됩니다. 따라서 종양 적합성과 완전성은 의미있는 데이터를 얻는 데 장벽으로 남아 있습니다. 종양 백분율이 낮은 샘플은 실제 변이체와 시퀀싱 아티팩트를 구별하는 데 어려움을 야기할 수 있으며 종종 NGS1에 적합하지 않습니다. 20% 미만의 낮은 종양 함량의 경우의 종양 농축은 재현 가능한 시퀀싱 데이터를 생성하고 저주파 변이체가 놓치지 않도록 충분한 물질을 산출하는 데 도움이 되는 것으로 나타났다2,3. 그러나 제한은 사용 된 플랫폼과 생성 된 데이터의 계획된 사용에 따라 다릅니다.
전통적으로, 추출을 위한 종양 영역의 농축은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 슬라이드의 수동 매크로해부 또는 레이저 포획 미세해부(LCM)에 의해 수행된다. 수동 매크로 해부 또는 슬라이드에서 지정된 조직 영역을 긁어내는 것은 종양 영역을 제거하여 상대적으로 저렴한 비용으로 하류 분석에 사용할 수 있지만 정확도는 낮고 정밀도는낮습니다 2,4. 최소한의 기술적 정확도는 종양의 큰 스와스가 존재하거나 최소한의 조직 손실이 결과에 큰 영향을 미치지 않는 높은 종양 함량의 경우 매우 효과적 일 수 있지만 종양 함량이 낮은 경우 또는 더 분산 된 종양이있는 경우 정밀도를 높여야합니다. 따라서 LCM은 1990 년대에 발명되었으며 포르말린 고정 파라 핀 임베디드 (FFPE) 슬라이드 5,6,7,8에서 조직의 작고 정의 된 미세한 영역을 정확하게 제거하는 귀중한 방법이되었습니다. LCM은 샘플의 복잡한 이질성이 존재할 때 단일 세포 집단을 수집하는데 활용될 수 있다(9) 이전에 분리하기 어려웠던 세포 집단의 수집을 허용한다. 그러나 LCM에는 광범위한 기술 전문 지식과 실습 시간10,11,12,13,14가 필요한 값 비싼 기계가 필요합니다.
자동 조직 해부에 사용되는 장비는 LCM (~ 10 μm)과 매크로 해부 (~ 1 mm) 사이의 정밀도를 가지고 있습니다 15. 추가적으로, 그것은 거대 해부와 LCM 사이의 비용 및 기술적 전문 지식 요구 사항을 모두 나타내며, 이전 방법(15)의 단점을 완화하기 위해 순차적 FFPE 슬라이드로부터 신속한 조직 농축을 수행하도록 설계되었습니다. 이러한 방식으로 자동화된 해부에서는 디지털 주석 또는 무대 위 슬라이드 참조 이미지 오버레이를 직렬로 단면화된 염색되지 않은 티슈 슬라이드에 활용하여 관심 영역을 해부하고 풍부하게 합니다. 이 기기는 플라스틱 방사 블레이드 밀링 팁, 1.5mL 수집 튜브를 사용하며 핵산 추출 및 시퀀싱을 포함한 다운스트림 분석을 위해 관심 영역을 수집하기 위해 해부용 다양한 유체와 함께 사용할 수 있습니다. 방사 플라스틱 밀링 팁은 내부 및 외부 시린지 배럴 저장소와 플런저를 사용하여 버퍼를 수집한 다음, 조직(16)을 밀링하고 수집한다. 가변 밀링 팁 크기 직경 (250 μm, 525 μm, 725 μm)은 비교를 위해 별도의 조직 영역, 풀링 될 수있는 다초점 영역 또는 단일 또는 다중 FFPE 슬라이드로부터의 개별 작은 영역의 해부를 허용 할 수 있습니다. 수확에 사용되는 섹션 두께는 개별 실험 요구에 따라 조정할 수 있으며 사용자는 수확에 사용 된 마지막 섹션 직후에 하나의 직렬 섹션에서 추가 H & E를 수행하여 관심 영역이 고갈되지 않았는지 확인할 수 있습니다.
자동 해부술은 종양 함량이 낮은 사례에서 종양 함량을 풍부하게하는 방법으로 확인되었으며 현재 FFPE 임상 표본에 사용하기 위해 판매되는 자동화 된 조직 해부 장비의 의도 된 기능을 최대 10 μm 두께로 테스트하고 확장했습니다. 이 연구는 자동화 된 해부가 연구 목적으로 FFPE 및 신선한 냉동 인간 또는 동물 조직 절편에 최대 20 μm 두께로 적용될 수 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 또한 종양 함량이 낮은 조직 및/또는 의미 있는 거대 해부가 어렵거나 실현 가능하지 않은 중첩되고 분산된 종양이 있는 경우 종양 농축을 위한 디지털 주석을 달고 해부를 자동화하는 접근법을 시연하고 NGS에 충분한 핵산의 품질과 수율을 보여줍니다. 따라서 자동 해부는 종양 농축을 위해 중간 수준의 정밀도와 증가 된 처리량을 제공 할 수 있으며 다른 관심 영역을 풍부하게하거나 연구 또는 임상 질문에 답하기 위해 다른 플랫폼과 결합 할 수도 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 것은 종양 농축 및 WES에서의 사용을 위해 낮은 종양 함량 FFPE 또는 신선한 냉동 조직으로부터 종양 영역을 해부하기 위한 디지털 주석 및 자동 해부의 적용을 위한 프로토콜이다. 디지털 주석과 마스크 생성을 자동화된 해부와 결합하면 수동 매크로 해부 및 LCM을 포함한 종양 농축의 고전적인 방법에 공통적으로 필요한 실무 시간과 전문 지식이 크게 줄어 듭니다. 이 프로토콜은 낮?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 자동 해부 개발에 대한 지원뿐만 아니라이 작업을 지원 한 Genentech Pathology Core Laboratory 직원에 대해 Carmina Espiritu와 Robin E. Taylor에게 감사하고 싶습니다.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
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