Automatisert disseksjonsprotokoll for tumorberikelse i vev med lavt tumorinnhold

Summary

Digital merknad med automatisert vevspredning gir en innovativ tilnærming til berikende svulst i tilfeller med lavt tumorinnhold og kan tilpasses både parafin- og frosne vevstyper. Den beskrevne arbeidsflyten forbedrer nøyaktigheten, reproduserbarheten og gjennomstrømningen og kan brukes på både forsknings- og kliniske innstillinger.

Abstract

Tumorberikelse i vev med lavt tumorinnhold, de under 20% tumorinnhold avhengig av metoden, er nødvendig for å generere kvalitetsdata reprodusert med mange nedstrømsanalyser som neste generasjons sekvensering. Automatisert vevspredning er en ny metodikk som automatiserer og forbedrer tumorberikelse i disse vanlige vevene med lavt tumorinnhold ved å redusere den brukeravhengige upresistensen av tradisjonell makro-disseksjon og tids-, kostnads- og kompetansebegrensninger for laserfangstmikrodisseksjon ved å bruke digital bildemerknadsoverlegg på unstained lysbilder. Her brukes digitale hematoksylin- og eosinmerknader (H&E) til å målrette mot små tumorområder ved hjelp av et blad som er 250 μm² i diameter i unstained formalin fast paraffin innebygd (FFPE) eller friske frosne seksjoner opp til 20 μm i tykkelse for automatisert tumorberikelse før nukleinsyreutvinning og hele eksomsekvensering (WES). Automatisert disseksjon kan høste kommenterte regioner i vev med lavt tumorinnhold fra enkelt- eller flere seksjoner for nukleinsyreutvinning. Det gjør det også mulig å fange opp omfattende målinger før og etter høsting, samtidig som nøyaktighet, reproduserbarhet og økende gjennomstrømning forbedres med utnyttelse av færre lysbilder. Den beskrevne protokollen muliggjør digital merknad med automatisert disseksjon på dyr og/eller humant FFPE eller ferskt frossent vev med lavt tumorinnhold og kan også brukes til enhver interesseregion for å øke tilstrekkeligheten for nedstrøms sekvenseringsapplikasjoner i kliniske eller forskningsarbeidsflyter.

Introduction

Neste generasjons sekvensering (NGS) brukes i økende grad til både pasientbehandling og i kreftforskning for å veilede behandlinger og legge til rette for vitenskapelig oppdagelse. Vev er ofte begrenset og små prøver med variabelt tumorinnhold brukes rutinemessig. Tumor tilstrekkelighet og integritet er derfor fortsatt en barriere for å skaffe meningsfulle data. Prøver med lavere tumorprosenter kan forårsake vanskeligheter med å skille sanne varianter fra sekvenseringsartefakter og er ofte ikke kvalifisert for NGS¹. Tumorberikelse av tilfeller med lavt tumorinnhold, de under 20%, har vist seg å bidra til å gi tilstrekkelig materiale for å generere reproduserbare sekvenseringsdata og sikre at lavfrekvente varianter ikke går glipp av ^2,3. Grensene vil imidlertid variere avhengig av plattformene som brukes og planlagt bruk av dataene som genereres.

Tradisjonelt utføres berikelse av tumorregioner for ekstraksjon ved manuell makrodisseksjon eller laserfangstmikrodisseksjon (LCM) av formalinfaste parafin innebygde (FFPE) lysbilder. Manuell makrodisseksjon, eller skraping av spesifiserte vevsområder fra lysbilder, gjør at tumorregioner kan fjernes for bruk i nedstrømsanalyser med relativt lave kostnader, men med lav nøyaktighet og lav presisjon ^2,4. Minimal teknisk nøyaktighet kan være svært effektiv med høyere tumorinnhold tilfeller der store svor av svulst er til stede og / eller minimalt vevstap påvirker ikke resultatene betydelig, men lav tumorinnhold tilfeller eller tilfeller med mer dispergert svulst krever økt presisjon. LCM ble derfor oppfunnet på 1990-tallet og ble en verdifull måte å nøyaktig fjerne små, definerte, mikroskopiske vevsregioner fra formalinfast parafin innebygd (FFPE) lysbilder 5,6,7,8. LCM kan brukes til å samle enkeltcellepopulasjoner når komplekse heterogenitet i utvalget eksisterer⁹, noe som gir mulighet for innsamling av tidligere vanskelige å skille cellepopulasjoner. LCM krever imidlertid kostbare maskiner som krever omfattende teknisk ekspertise og praktisk tid 10,11,12,13,14.

Instrumentet som brukes til automatisert vevs disseksjon har presisjon mellom LCM (~ 10 μm) og makrodesisseksjoner (~ 1 mm) ¹⁵. I tillegg viser den både kostnads- og tekniske kompetansekrav mellom makrodeseksjon og LCM og er designet for å utføre rask vevsberikelse fra sekvensielle FFPE-lysbilder for å lindre ulempene ved tidligere metoder¹⁵. Automatisert disseksjon på denne måten benytter digitale merknader eller lysbildereferansebildeoverlegg på seriell seksjonerte, ubeskårne vevslysbilder for dissekering og berikelse av interesseområder. Instrumentet bruker plastspinningsbladfresespisser, 1,5 ml oppsamlingsrør og kan brukes med en rekke forskjellige væsker for disseksjon for å samle interesseområder for nedstrømsanalyser inkludert nukleisk ekstraksjon og sekvensering. Den roterende plastfresespissen benytter indre og ytre sprøytefatreservoarer og et stempel for å samle buffer, deretter møller og samler vev¹⁶. Den variable fresespissens størrelsesdiameter (250 μm, 525 μm, 725 μm) kan tillate disseksjon av separate vevsområder for sammenligning, multifokale regioner som kan samles eller individuelle små områder fra enkle eller flere FFPE-lysbilder. Seksjonstykkelser som brukes til høsting kan justeres basert på individuelle eksperimentbehov, og brukere kan sikre at interesseområder ikke har blitt utarmet ved å utføre en ekstra H&E på en seriell seksjon umiddelbart etter den siste delen som brukes til høsting.

Automatisert disseksjon ble identifisert som en måte å berike tumorinnhold i tilfeller med lavt tumorinnhold, og vi testet og utvidet den tiltenkte funksjonaliteten til et automatisert vevs disseksjonsinstrument, som for tiden markedsføres for bruk på FFPE kliniske prøver opp til 10 μm i tykkelse. Arbeidet viser at automatisert disseksjon kan brukes på både FFPE og ferske frosne menneske- eller dyrevevsseksjoner opp til 20 μm i tykkelse for forskningsformål. Protokollen viser også en tilnærming til digitalt kommentering og automatiser disseksjon for tumorberikelse i vev med lavt tumorinnhold og/eller tilfeller med nestet, spredt svulst der meningsfull makrodisseksjon er utfordrende eller ikke mulig og viser både kvalitet og utbytte av nukleinsyre som er tilstrekkelig for NGS. Automatisert disseksjon kan derfor gi presisjon på mellomnivå og økt gjennomstrømning for tumorberikelse og kan også brukes til å berike andre interesseregioner eller kombinert med andre plattformer for å svare på forskning eller kliniske spørsmål.

Protocol

Før oppstart, få passende vevsprøver i henhold til Institutional Review Board (IRB) protokoller. Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Genentech, Inc. 1. Vev og glideforberedelse Velg FFPE eller ferske frosne vevsblokker og bruk den tilsvarende behandlingsmetoden nedenfor. Klipp vev blokk seksjoner på positivt ladet glass lysbilder på ønsket tykkelse. Del FFPE-vevet i bånd med den første referansedelen kuttet…

Representative Results

FFPE og FF mus lever seksjoner som inneholder metastatisk kolorektal kreft i xenografts ble valgt. Seksjonene var H&E-farget (figur 1A, E, I) og skannet på en hel lysbildebilde ved 20x forstørrelse. En patolog digitalt kommenterte tumorregioner av interesse og en maske ble generert ved hjelp av kommersiell programvare og formatert som et digitalt png-referansebilde (Figur 1B, F, J). Serielle 10 μm og 20 μm tykke unstained pr…

Discussion

Presentert her er en protokoll for anvendelse av digital merknad og automatisert disseksjon for å dissekere tumorregioner fra lavt tumorinnhold FFPE eller ferskt frossent vev for tumorberikelse og bruk i WES. Ved å kombinere digital merknad og maskeoppretting med automatisert disseksjon reduserer den nødvendige praktiske tiden og ekspertisen som er felles for klassiske metoder for tumorberikelse, inkludert manuell makrodisseksjon og LCM, betydelig. Protokollen demonstrerer et potensielt viktig mellomtone tumorberikels…

Materials

Agilent SureSelectXT	Agilent	G9611A
AVENIO Millisect Fill Station	Roche	8106533001
AVENIO Millisect Instrument, Base	Roche	8106568001
AVENIO Millisect Instrument, Head	Roche	8106550001
AVENIO Millisect Milling Tips Small	Roche	8106509001
AVENIO Millisect PC	Roche	8106495001
BioAnalyzer	Agilent	G2939BA
Eppendorf 5427R	Eppendorf	22620700	Micro-centrifuge
Incubation Buffer	Promega	D920D
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010	Automated stainer
Molecular Grade Mineral Oil	Sigma	M5904-500ML
Proteinase K	Promega	V302B	Digestion buffer
Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80284
RLT Plus buffer	Qiagen	80204
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214