Summary
بروتين أرجينين (R) - مثيلة هو تعديل واسع الانتشار بعد الترجمة ينظم مسارات بيولوجية متعددة. يعد قياس الطيف الكتلي أفضل تقنية لتحديد ملامح R-methyl-proteome عالميا ، عندما يقترن بالنهج الكيميائية الحيوية لتخصيب الببتيد المعدل. يتم وصف سير العمل المصمم لتحديد الثقة العالية لمثيلة R العالمية في الخلايا البشرية هنا.
Abstract
بروتين أرجينين (R) - مثيلة هو بروتين واسع الانتشار بعد التعديل الانتقالي (PTM) يشارك في تنظيم العديد من المسارات الخلوية ، بما في ذلك معالجة الحمض النووي الريبي ، ونقل الإشارة ، والاستجابة لتلف الحمض النووي ، والتولد الحيوي للحمض النووي الريبي ، والترجمة.
في السنوات الأخيرة ، وبفضل التطورات البيوكيميائية والتحليلية ، برزت البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) باعتبارها الاستراتيجية الأكثر فعالية لتوصيف بروتينات الميثيل الخلوية بدقة موقع واحد. ومع ذلك ، فإن تحديد وتنميط مثيلة البروتين الحي R-methylation بواسطة MS لا يزال يمثل تحديا وعرضة للخطأ ، ويرجع ذلك أساسا إلى الطبيعة التكميلية لهذا التعديل ووجود بدائل مختلفة للأحماض الأمينية وأسترة الميثيل الكيميائية للمخلفات الحمضية التي تكون متساوية الضغط للمثيلة. ومن ثم، يلزم اتباع أساليب إثراء لتعزيز تحديد ببتيدات R-methyl واستراتيجيات التحقق المتعامدة للحد من معدلات الاكتشاف الخاطئ في دراسات بروتينات الميثيل.
هنا ، يتم وصف بروتوكول مصمم خصيصا لتحديد ببتيدات R-methyl عالية الثقة وكميتها من العينات الخلوية ، والذي يجمع بين وضع العلامات الأيضية للخلايا مع الميثيونين المشفر بالنظائر الثقيلة (hmSILAC) وهضم البروتياز المزدوج في المحلول لمستخلص الخلية الكاملة ، متبوعا بتجزئة كروماتوغرافيا المرحلة المعكوسة عالية الأس الهيدروجيني (HpH-RP) خارج الخط وإثراء تقارب R-methyl-peptides باستخدام الأجسام المضادة المضادة لعموم R-methyl. عند تحليل MS عالي الدقة ، تتم معالجة البيانات الأولية أولا باستخدام حزمة برامج MaxQuant ثم يتم تحليل النتائج بواسطة hmSEEKER ، وهو برنامج مصمم للبحث المتعمق لأزواج ذروة MS المقابلة لببتيد الميثيل الخفيف والثقيل داخل ملفات إخراج MaxQuant.
Introduction
أرجينين (R) - مثيلة هو تعديل ما بعد الترجمة (PTM) الذي يزين حوالي 1 ٪ من البروتينالثديي 1. بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMTs) هي الإنزيمات التي تحفز تفاعل R-methylation عن طريق ترسب مجموعة أو مجموعتين من الميثيل إلى ذرات النيتروجين (N) لمجموعة guanidino من السلسلة الجانبية ل R بطريقة متماثلة أو غير متماثلة. في الثدييات ، يمكن تجميع PRMTs في ثلاث فئات - النوع الأول والنوع الثاني والنوع الثالث - اعتمادا على قدرتها على إيداع كل من المثيلة الأحادية (MMA) وثنائي المثيلة غير المتماثل (ADMA) و MMA وثنائي المثيلة المتماثل (SDMA) أو MMA فقط ،على التوالي 2,3. تستهدف PRMTs بشكل أساسي بقايا R الموجودة داخل المناطق الغنية بالجليكاين والأرجينين ، والمعروفة باسم زخارف GAR ، ولكن بعض PRMTs ، مثل PRMT5 و CARM1 ، يمكن أن تكون ميثيل البرولين - الجلايسين - الزخارف الغنية بالميثيونين (PGM)4. برز R-methylation كمغير بروتين للعديد من العمليات البيولوجية ، مثل ربط الحمض النوويالريبي 5 ، وإصلاح الحمض النووي6 ، والتولد الحيويmiRNA 7 ، والترجمة2 ، مما يعزز البحث في PTM هذا.
يعرف قياس الطيف الكتلي (MS) بأنه أكثر التقنيات فعالية لدراسة مثيلة R العالمية بشكل منهجي بدقة البروتين والببتيد والموقع. ومع ذلك ، يتطلب PTM هذا بعض الاحتياطات الخاصة لتحديد الثقة العالية من قبل MS. أولا ، R-methylation هو قياس ، حيث يكون الشكل غير المعدل للببتيدات أكثر وفرة من الببتيدات المعدلة ، بحيث تقوم مطياف الكتلة التي تعمل في وضع اكتساب البيانات (DDA) بتجزئة الببتيدات غير المعدلة عالية الكثافة في كثير من الأحيان أكثر من نظيراتها الميثيلية منخفضة الكثافة8. علاوة على ذلك ، فإن معظم تدفقات العمل المستندة إلى MS لتحديد موقع R-methylated تعاني من قيود على مستوى التحليل المعلوماتي الحيوي. في الواقع ، فإن التحديد الحسابي لببتيدات الميثيل عرضة لمعدلات اكتشاف خاطئة عالية (FDR) ، لأن PTM هذا متساوي الضغط لبدائل الأحماض الأمينية المختلفة (على سبيل المثال ، الجلايسين في ألانين) والتعديل الكيميائي ، مثل أسترة الميثيل للأسبارتات والغلوتامات9. ومن ثم ، فقد تم تنفيذ طرق تستند إلى توسيم النظائر لمجموعات الميثيل ، مثل وضع العلامات على النظائر المستقرة للميثيل الثقيل مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (hmSILAC) ، كاستراتيجيات متعامدة لتحديد MS الواثق للمثيلات في الجسم الحي ، مما يقلل بشكل كبير من معدل التعليقات التوضيحية الإيجابية الخاطئة10.
في الآونة الأخيرة ، تم تحسين بروتوكولات مختلفة على مستوى البروتين لدراسة البروتينات R-methylated. أدى تطوير الاستراتيجيات القائمة على الأجسام المضادة لإثراء التقارب المناعي لببتيدات R-methyl-peptides إلى شرح عدة مئات من مواقع R-methylated في الخلايا البشرية11,12. علاوة على ذلك ، ذكرت العديد من الدراسات 3,13 أن اقتران الإثراء القائم على الأجسام المضادة بتقنيات فصل الببتيد مثل تجزئة كروماتوغرافيا HpH-RP يمكن أن يعزز العدد الإجمالي لببتيدات الميثيل المحددة.
تصف هذه المقالة استراتيجية تجريبية مصممة لتحديد منهجي وعالي الثقة لمواقع R-methylated في الخلايا البشرية ، بناء على خطوات كيميائية حيوية وتحليلية مختلفة: استخراج البروتين من الخلايا التي تحمل علامة hmSILAC ، والهضم الأنزيمي المزدوج المتوازي مع بروتياز التربسين و LysargiNase ، متبوعا بتجزئة كروماتوغرافية HpH-RP للببتيدات المهضومة ، إلى جانب إثراء التقارب المناعي القائم على الأجسام المضادة ل MMA- ، SDMA- ، والببتيدات المحتوية على ADMA. ثم يتم تحليل جميع الببتيدات المخصبة بالتقارب بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الدقة (LC) -MS / MS في وضع DDA ، وتتم معالجة بيانات MS الخام بواسطة خوارزمية MaxQuant لتحديد R-methyl-peptides. أخيرا ، تتم معالجة نتائج إخراج MaxQuant باستخدام hmSEEKER ، وهي أداة معلوماتية حيوية مطورة داخليا للبحث عن أزواج من ببتيدات الميثيل الثقيلة والخفيفة. باختصار ، يقرأ hmSEEKER ويصفي تعريفات ببتيدات الميثيل من ملف msms ، ثم يطابق كل ببتيد ميثيل مع ذروة MS1 المقابلة له في ملف جميع الببتيدات ، وأخيرا ، يبحث في ذروة نظيره الببتيد الثقيل / الخفيف. لكل زوج من أزواج الضوء الثقيل المفترضة ، يتم حساب نسبة Log2 H / L (LogRatio) وفرق وقت الاحتفاظ (dRT) ومعلمات خطأ الكتلة (ME) ، ويتم تصنيف الثنائيات الموجودة داخل عمليات القطع المحددة من قبل المستخدم على أنها إيجابيات حقيقية. يتم وصف سير عمل البروتوكول الكيميائي الحيوي في الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة الخلايا واستخراج البروتين (الوقت: 3 - 4 أسابيع مطلوبة)
- تنمو خلايا هيلا بالتوازي في وسط مزود إما بالميثيونين الخفيف (L) أو الثقيل (H) ، على التوالي (انظر الجدول 1 لتكوين الوسائط). عند ثمانية انقسامات خلوية على الأقل ، اجمع حصة من الخلايا من كل قناة SILAC وقم بإجراء اختبار الدمج.
ملاحظة: للتحقق من كفاءة الدمج ، اختبر عن طريق تحليل LC-MS / MS أن النسبة المئوية للميثيونين الثقيل (Met-4) في القناة الثقيلة قريبة قدر الإمكان من 100٪. قم بتحليل حصص الخلايا ذات العلامات الثقيلة بواسطة LC-MS / MS (للإعدادات انظر الجدول 2) ، ثم قم بمعالجة بيانات MS باستخدام MaxQuant باستخدام المعلمات المشار إليها في الجدول 3. للتحقق من دمج Met-4 ، يتوفر برنامج نصي مطور داخليا في https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. - النظر في دمج الميثيونين الثقيلة على أنها كاملة عندما تصل إلى >97٪. عندما تصل كل قناة إلى إجمالي عدد حوالي 60 × 106 من الخلايا (المقابلة لحوالي 40 طبقا كل منها 15 سم عند التقاء 85٪ لخلايا HeLa ، مع اختلافات حسب نوع الخلية) قم بحصادها. قم بحسابها بعناية ، واخلطها بنسبة 1: 1 والحبيبات بالطرد المركزي عند 335 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لتقييم الخلط المناسب 1: 1 لتر / ساعة ، احتفظ بحصة وشغلها على شريحة من الجل المعروف باحتوائها على وفرة عالية وبروتين ميثيل R بشكل كبير (على سبيل المثال ، الفيبريلارين). إذا كان وضع العلامات ناجحا وتم تحقيق خلط 1: 1 ، فيجب أن تكون هناك نسبة 1: 1 من الإصدارات الخفيفة والثقيلة من الببتيدات R-methylated الموجودة في العينة. بدلا من ذلك ، احتفظ بحصة من العينة المختلطة ليتم تحليلها بواسطة LC-MS / MS ، ثم قم بمعالجة بيانات MS باستخدام MaxQuant باستخدام المعلمات المشار إليها في الجدول 3 وارسم توزيع نسبة Log2 H / L كما هو موضح في الشكل 2C. يمكن إيقاف البروتوكول هنا عن طريق تجميد الحبيبات وتخزينها عند -80 درجة مئوية. - أعد تعليق حبيبات الخلية في أربعة مجلدات من Lysis Buffer (انظر الجدول 1 لتكوين Lysis Buffer) فيما يتعلق بحجم حبيبات الخلية. على سبيل المثال ، استخدم 6 مل من Lysis Buffer لحبيبات من 120 × 10 6 خلايا Hela (60 × 10 6 خفيفة + 60 × 106 ثقيلة) المقابلة لحجم 1.5 مل.
ملاحظة: يجب إجراء استخراج البروتين في درجة حرارة الغرفة (RT) لأن Lysis Buffer يحتوي على عامل chaotropic 9 M Urea الذي يترسب عند درجة حرارة الجليد ؛ لذلك ، فإن إضافة مجموعة واسعة من مثبطات الأنزيم البروتيني سيرين والسيستين أمر مهم ، وكذلك مثبطات الفوسفاتاز ، لحماية البروتينات في وقت واحد من التدهور البروتيني وإزالة الفسفرة ، كوكتيل من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز متوفرة تجاريا كأقراص صغيرة ، انظر الجدول 1 وجدول المواد. - قم بتقطيع العينة باستخدام صوتي معطل للخلايا الدقيقة لمدة خمس دورات على الأقل من 15 ثانية ON و 30 ثانية OFF ، لضمان الكسر الفعال لأغشية الخلايا وإطلاق الحمض النووي والقص. تحقق من لزوجة المستخلص عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل. إذا كان لزجا جدا بسبب قص الحمض النووي غير المكتمل وذوبان الغشاء ، كرر دورات الصوتنة.
ملاحظة: تأكد من أن العينة لا تسخن أثناء الصوتنة ، لأن ارتفاع درجة الحرارة يمكن أن يتلف البروتينات. ومع ذلك ، لا يمكن وضع العينة على الجليد بين دورات الصوتنة ، بسبب وجود 9M Urea ؛ وبالتالي ، فمن المستحسن أن تتوقف لمدة 60 ثانية OFF بين دورات صوتنة مختلفة. علاوة على ذلك ، تجنب تكوين فقاعات الهواء أثناء الصوتنة لأنها تقلل من فعالية الصوتنة. - قم بالطرد المركزي للمستخلص عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق في RT لحبيبات الحطام ونقل المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 15 مل.
- قم بقياس محتوى البروتين في المستخلص باستخدام مقايسة لونية ، مثل برادفورد أو حمض البيسينشونيك (BCA)14,15. تتراوح كمية البدء المثلى لمستخلص البروتين لهذا البروتوكول بين 20-30 مجم.
ملاحظة: مخازن التحلل التي تحتوي على اليوريا عالية التركيز متوافقة مع كل من مقايسة القياس الكمي لبرادفورد و BCA ؛ الأنواع الأخرى من محلول التحلل ، مثل تلك التي تحتوي على تركيز عال من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، غير متوافقة مع برادفورد.
2. الهضم المحللة (الوقت الإرشادي المطلوب 2 ساعة)
- قم بإجراء تقليل مجموعة الثيول (-SH) من البروتينات باستخدام محلول مخزون من ثنائي ثيوثريتول (DTT) المذاب في ماء عالي النقاء بتركيز نهائي قدره 4.5 mM واترك التفاعل لمدة 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
ملاحظة: من الممكن تحضير محلول DTT بمخزون 1 M وتخزينه عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد ، مع إذابة القسمة اللازمة لكل تجربة فقط. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام سلفهيدريل المختزل tris- (2-carboxyethyl) - فوسفين (TCEP) لإجراء تقليل مجموعات -SH ؛ خاصة بالنسبة لتخزين البروتينات على المدى الطويل ، يكون TCEP أكثر استقرارا بشكل ملحوظ من DTT بدون مخلبات معدنية مثل EGTA في المخزن المؤقت ، في حين أن DTT يكون أكثر استقرارا إذا كانت مخلبات المعادن موجودة16. - أداء ألكلة مجموعة ثيول (-SH) من البروتينات عن طريق إضافة يودواسيتاميد (IAA) بتركيز 10 mM واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام. قم بإجراء حضانة البروتينات المستخرجة باستخدام محلول إندول حمض الأسيتيك في الظلام لأن إندول حمض الأسيتيك حساس للضوء.
ملاحظة: يجب تحضير محلول مخزون إندول حمض الأسيتيك عند 100 mM طازجا قبل كل تجربة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الكلوروأسيتاميد لأداء ألكلة مجموعات -SH ، خاصة إذا كان الهدف من التجربة هو تحليل الحديث المتبادل بين المثيلة والوجود في كل مكان لأن القطع الأثرية التي يسببها IAA تحاكي الوجود في كل مكان17. - قبل الشروع في خطوة هضم البروتين ، احتفظ بحصة من مستخلص البروتين (1/1000 من محللة بدء غير مهضوم) للتحليل اللاحق على جل SDS-PAGE Coomassie الملون ومقارنته بكمية مقابلة من العينة عند الهضم ؛ يعمل هذا الاختبار على التحقق من كفاءة التحلل البروتيني (انظر النقطة 4).
- تمييع مستخلص البروتين المتبقي بأربعة مجلدات من 20 mM HEPES pH 8.0 ، للوصول إلى تركيز اليوريا النهائي البالغ 2 M (وهو التركيز المتوافق مع النشاط الأنزيمي للبروتياز). قسم العينة إلى جزأين: في الأول أضف التربسين المعدل بدرجة التسلسل وفي الجزء الثاني أضف بروتياز LysargiNase (انظر جدول المواد) بنسبة 1: 100 (وزن / وزن) بالنسبة إلى ملغ من المواد الأولية. اتركيه طوال الليل عند 37 درجة مئوية في خلاط حراري عند 600 دورة في الدقيقة ، للسماح بالهضم الأنزيمي.
ملاحظة: التربسين ، وهو إنزيم الهضم الأكثر شيوعا في البروتينات ، ينشق عند النهاية C ل R و Lysine (K) ، مما يولد الببتيدات مع توزيع الشحنة الذي ينتج عنه أطياف تجزئة تهيمن عليها أيونات من النوع y عند التفكك الناجم عن الاصطدام (CID). يلتصق LysargiNase عند النهاية N ل R و K ، وبالتالي ، يعكس خصوصية انقسام التربسين ويولد الببتيدات التي تطلق أيونات من النوع b بشكل أساسي عند تجزئة CID. يؤدي هذا التحليل المشترك إلى زيادة كبيرة في تغطية تسلسل الببتيد وثقة أعلى في تحديد موقع معين لمثيلات R18.
3. تنقية الببتيد (الوقت الإرشادي المطلوب 1 ساعة)
- احتفظ بحصة من الببتيدات المهضومة من كلا التفاعلين ، وجمع نفس الأحجام كما في النقطة 2.3 للمقارنة على SDS-PAGE Coomassie-stained gel لتقييم كفاءة هضم الأنزيم البروتيني (انظر النقطة 4).
- أوقف عملية الهضم عن طريق تحمض العينات بإضافة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) إلى تركيز نهائي بنسبة 5٪. تخلط جيدا وقياس درجة الحموضة العينات مع ورقة عباد الشمس (يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني حوالي 3). دوامة لفترة وجيزة وتدوير العينات المحمضة قبل نقلها إلى أنابيب جديدة 15 مل.
- نظف العينات من خلال خرطوشتي C18 vac (وزن المادة الماصة 1 جم ، انظر جدول المواد) ، واحدة للعينة المهضومة باستخدام التربسين والأخرى للعينة المهضومة باستخدام LysargiNase. قم بإعداد المذيب A والمذيب B ومحلول الغسيل (انظر الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت).
- باستخدام الماصات الزجاجية ، أعد ترطيب كل خرطوشة ب 6 مل من ACN 100٪ لمدة 3 مرات. بعد ذلك ، قم بموازنة كل خرطوشة بالتتابع مع 3-9-18 مل من المذيب أ. قم بتحميل العينات (يجب أن تصبح الراتنجات صفراء). اغسل مرة أخرى بالتتابع باستخدام 3-9-18 مل من المذيب أ ثم أضف 6 مل من محلول الغسيل. انقل كل عمود إلى أنابيب نظيفة سعة 15 مل وقم بتخفيف العينات باستخدام 7 مل من المذيب B. كرر خطوة الشطف مع 7 مل من المذيب B ، للحصول على حجم نهائي يبلغ 14 مل.
ملاحظة: قم بتنفيذ كل هذه الخطوات عن طريق السماح للمخازن المؤقتة والحل بالمرور عبر الأعمدة عن طريق الجاذبية. لتفضيل تدفق المخازن المؤقتة عبر العمود ، ادفع كل محلول ببطء باستخدام حقنة ، لتقليد الفراغ. - وفر 50 ميكرولتر من الببتيدات الممزقة ، و 50 ميكرولتر من التدفق (FT) ، و 50 ميكرولتر من الغسيل بالمذيب A ، و 50 ميكرولتر من آخر غسل لتقييم الببتيد اللاحق بواسطة SDS-PAGE (انظر النقطة 4).
4. جل SDS-PAGE الملون Coomassie (الوقت الإرشادي المطلوب 2 ساعة)
- قم بتشغيل الحصص المجمعة على جل SDS-PAGE بنسبة 17.5٪ وصبغه باستخدام تلطيخ Instant-Blu Coomassie (انظر جدول المواد). يتم تمثيل النتيجة المتوقعة في الشكل 2 أ.
5. التجفيف بالببتيد (الوقت الإرشادي 2 أيام)
- قم بتغطية أنابيب 15 مل التي تحتوي على الببتيدات الممسوطة بفيلم البارافين ، والذي يتم ثقبه بعد ذلك بإبرة 20 جم لإنشاء 3-5 ثقوب. ضع الأنابيب في ثلج جاف لمدة 30 دقيقة على الأقل ، حتى يتم تجميد العينات تماما.
- تجفيف الكسور المجمدة لمدة 48 ساعة ، وهي فترة زمنية كافية عادة لضمان التجفيد الكامل للعينات ، حتى لو حدث بعض التباين ، بسبب أداء مجفف التجميد.
ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا ، وتخزين العينات المجففة بالتجميد عند -80 درجة مئوية.
6. تجزئة كروماتوغرافية HpH-RP خارج الخط للببتيدات (وقت إرشادي 4 أيام)
- لتجزئة الببتيدات إلى 60 جزءا ، استخدم كروماتوغرافيا HpH-RP السائلة ، باستخدام نظام HPLC المجهز بعمود C12-RP HPLC (250 × 4.6 مم ، 4 ميكرومتر بروتيو 90A).
- قبل التشغيل ، قم بإعداد المخزن المؤقت A و B الجديدين (يتم وصف تكوين المخازن المؤقتة في الجدول 1).
- قم بتصفية جميع المحلول بفلتر 0.22 ميكرومتر وقم بتفريغها في حمام صوتي لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- قم بإذابة الببتيدات المجففة بالتجميد في 1 مل من Buffer A. قم بتصفية الببتيدات من خلال مرشح polytetrafluoroethylene (PTFE) 0.45 ميكرومتر ، باستخدام حقنة.
- اضبط معدل التجزئة على تدفق 1 مل / دقيقة واجمع 1 مل من الكسور ، باستخدام التدرج الكروماتوجرافي التالي: 5٪ B إلى 30٪ B في 60 دقيقة ؛ 30٪ ب إلى 60٪ في 2 دقيقة ؛ 70٪ B لمدة 3 دقائق.
- اضبط HPLC بحيث يتم إيقاف تجميع الكسور في هذه المرحلة ، ويتم تثبيت التدرج عند 70٪ Buffer B لمدة 5 دقائق قبل الغسيل الشامل للعمود بتدرج سريع يصل إلى 100٪ Buffer B ، متبوعا بغسل نهائي (100٪ Buffer B لمدة 10 دقائق).
ملاحظة: في نهاية كل تشغيل كروماتوغرافي ، قم دائما بموازنة العمود مع 100٪ Buffer A لمدة 20 دقيقة. - تجزئة كلتا العينتين بشكل منفصل مهضومة مع التربسين و LysargiNase بواسطة التدرجات الكروماتوغرافية HpH RP خارج الخط ، كما هو موضح في النقطة 6.5.
- لكل تدرج كروماتوغرافي ، اجمع كل الكسور في لوحة بئر عميقة 96.
- قم بتجميع الكسور التي تم جمعها قبل التدرج في كسر واحد يسمى PRE. قم بربط 60 كسرا من التدرج الكروماتوغرافي السائل HpH-RP (LC) عن طريق تجميعها بطريقة غير متجاورة في 14 كسرا نهائيا. للحصول على مثل هذا التسلسل غير المتجاور ، قم بتجميع كسور HpH-RP وفقا للمخطط التالي.
- الكسر 1 (الحجم النهائي 5 مل): المسبح 1-15-29-43-57
- الكسر 2 (الحجم النهائي 5 مل): تجمع 2-16-30-44-58
- الكسر 3 (الحجم النهائي 5 مل): تجمع 3-17-31-45-59
- الكسر 4 (الحجم النهائي 5 مل): حمام السباحة 4-18-32-46-60
- الكسر 5 (الحجم النهائي 4 مل): حمام السباحة 5-19-33-47
- الكسر 6 (الحجم النهائي 4 مل): حمام السباحة 6-20-34-48
- الكسر 7 (الحجم النهائي 4 مل): المسبح 7-21-35-49
- الكسر 8 (الحجم النهائي 4 مل): تجمع 8-22-36-50
- الكسر 9 (الحجم النهائي 4 مل): حمام السباحة 9-23-37-51
- الكسر 10 (الحجم النهائي 4 مل): تجمع 10-24-38-52
- الكسر 11 (الحجم النهائي 4 مل): تجمع 11-25-39-53
- الكسر 12 (الحجم النهائي 4 مل): حمام السباحة 12-26-40-54
- الكسر 13 (الحجم النهائي 4 مل): حمام السباحة 13-27-41-55
- الكسر 14 (الحجم النهائي 4 مل): تجمع 14-28-42-56
ملاحظة: يتكون التسلسل غير المتجاور من الجمع بين الكسور المبكرة والمتوسطة والمتأخرة ، مما يسمح بزيادة عدم التجانس في تكوين الببتيد داخل الكسور المجمعة. وبالتالي ، يتم فصل خليط الببتيد لكل جزء مجمع بكفاءة ، مع شطف مشترك محدود ، في كروماتوغرافيا pH-RP-LC المنخفضة ذات التدفق النانوي اللاحق المقترنة مباشرة بمطياف الكتلة.
- قم بتجميع الكسور التي تم جمعها بعد التدرج في كسر فريد يسمى POST.
ملاحظة: من خلال تضمين الكسور PRE وتدرج POST ، يتم الحصول على ما مجموعه 16 كسرا ، في أنابيب سعة 15 مل (انظر الشكل 3 أ). - قم بتغطية الأنابيب سعة 15 مل بفيلم البارافين واثقبها بإبرة 20 جم لتوليد 3-5 ثقوب. قم بتجميدها عن طريق احتضان أنابيب الطرد المركزي في الثلج الجاف حتى يتم تجميد كل جزء تماما.
- تجفيف الكسور بالتبريد لمدة 48 ساعة تقريبا. تأكد من تجفيف كل عينة تماما قبل إيقاف مجفف التجميد.
ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا ، وتخزين العينات المجففة بالتجميد عند -80 درجة مئوية.
7. R- methylated الببتيد المناعي التقارب إثراء (الوقت الإرشادي 2 أيام)
- قم بإجراء التخصيب المناعي المتسلسل للببتيد المعدل بالأجسام المضادة المضادة لمثيلة عموم R بالتوازي ، ولكن بشكل منفصل للعينتين من هضم Trypsin و LysargiNase ، على التوالي. يتم توفير المخزن المؤقت لتنقية التقارب المناعي (IAP) من قبل الشركة التي تشتري الأجسام المضادة المضادة ل Pan-R-methyl لإثراء تقارب الببتيد المعدل (التفاصيل موجودة في مواد الجدول والكواشف). يتركز المخزن المؤقت IAP 10x ويجب تخفيفه 10 مرات قبل الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تخزين IAP Buffer 1x في -20 درجة مئوية إلى ما يصل إلى عام واحد. - قم بالطرد المركزي للببتيدات المجففة بالتجميد عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق في RT لتدوير الببتيدات إلى أسفل الأنبوب سعة 15 مل. أعد تعليق الببتيدات المجففة بالتجميد باستخدام 250 ميكرولتر من 1x IAP Buffer لكل أنبوب 15 مل وانقلها في أنبوب منخفض الربط سعة 1.5 مل. تحقق باستخدام ورقة عباد الشمس ما إذا كان الرقم الهيدروجيني >6.
- احتفظ بقسمة صغيرة (حوالي 5٪ من الحجم) لكل كسر كمدخل لتحليل MS اللاحق.
- قسم كل جزء إلى قسمين ، من أجل إجراء التخصيب المناعي للببتيدات غير المتماثلة ثنائية الميثيل (ADMA) والببتيدات ثنائية الميثيل المتماثلة (SDMA) بالتوازي.
- استخدم ثلاث قوارير من الأجسام المضادة المختارة المضادة لعموم R المترافقة مع حبات أغاروز البروتين A لكل 10 ملغ من مستخلص البروتين الأولي.
- قم بإعداد الكمية الصحيحة من الأجسام المضادة المترافقة مع حبات الأغاروز عن طريق طرد كل قارورة بسرعة 2000 × جم لمدة 30 ثانية وإزالة المخزن المؤقت من الخرزات. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام 1 مل من 1x PBS دائما عن طريق الطرد المركزي لها عند 2,000 × جم لمدة 30 ثانية.
- بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخرز في 40 ميكرولتر 1x PBS لكل قارورة ؛ قم بتجميعها وأخيرا قسمها بالتساوي إلى 16 كسرا (بحيث يتم إضافة 2.5 ميكرولتر من حبات الأجسام المضادة إلى كل جزء).
- أضف 250 ميكرولتر من 1x IAP Buffer إلى كل أنبوب ، واخلطه عن طريق الانقلاب واتركه يحتضن على عجلة دوارة لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: امزج العينات عن طريق قلب الأنابيب سعة 1.5 مل بدلا من سحبها بأطراف دقيقة ، مما قد يؤدي إلى إتلاف الخرز أو فقدانها. - عند حضانة 2 ساعة ، قم بالطرد المركزي لأنابيب 1.5 مل التي تحتوي على الببتيدات والخرز المترافق بالأجسام المضادة Pan-R-methyl-antibody عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية لحبيبات الخرز ؛ انقل FT من كل جزء إلى أنابيب نظيفة منخفضة الربط سعة 1.5 مل.
- أضف الخرزات المترافقة إلى الأجسام المضادة ضد R-mono-methylation (MMA) إلى FTs وكرر الخطوات من 7.7 إلى 7.9.
- أثناء حضانة عينات الببتيد مع حبات MMA ، اغسل ضعف الكسور التي كانت في السابق مترسبة مناعية بمضادات ADMA و SDMA باستخدام 250 ميكرولتر IAP Buffer (عكس وليس سحب) ، وتخلص من المادة الطافية في كل غسلة.
- كرر الغسيل باستخدام LC-MS بدرجة H2O ثلاث مرات.
- قم بتخفيف الببتيدات المخصبة بالتقارب بشكل متماثل وغير متماثل R-di-methylated من حبات الأغاروز عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من 0.15٪ TFA إلى كل أنبوب (ظروف الحمض القوية ، في الواقع ، تشوه الحاشية مما يؤدي إلى إطلاق المستضدات من الأجسام المضادة). اترك هذا المحلول لمدة 10 دقائق في RT ، مع قلب الأنابيب كل 2-3 دقائق.
- انقل الشطف الأول إلى أنابيب منخفضة الربط نظيفة سعة 1.5 مل وكرر الشطف باستخدام 50 ميكرولتر 0.15٪ TFA ؛ تجمع الكسور 2 في أنبوب واحد.
- كرر الخطوات من 7.11 إلى 7.14 للببتيدات R-mono-methylated التي تم تحضينها مع حبات الأجسام المضادة ل MMA.
8. تحلية وتركيز ببتيدات الميثيل المخصبة بالتقارب بواسطة الأعمدة الدقيقة C18 (الوقت الإرشادي المطلوب 30 دقيقة)
- قم بموازنة الأعمدة الدقيقة C18-RP المصنوعة من خراطيش استخراج الطور الصلب 3M مع الميثانول لإزالة الببتيد وتركيزه قبل تحليل MS19.
- قم بتحميل العينات (المقابلة للكسور المنفصلة المخصبة بالتقارب المناعي وكسور الإدخال) على الأعمدة الدقيقة C18 في خطوتين (50 ميكرولتر + 50 ميكرولتر على كل عمود دقيق C18) عن طريق الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 6 دقائق.
- اغسل الأعمدة الدقيقة ب 55 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (انظر الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت) ، دائما عن طريق الطرد المركزي عند حوالي 900 × جم لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا ، وترك الأعمدة الدقيقة C18-RP عند 4 درجات مئوية ، حيث يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
9. الهضم الأنزيمي الثاني (الوقت الإرشادي المطلوب 3 ساعات)
- اغسل الأعمدة الدقيقة C18-RP ب 55 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (انظر الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت) لمرتين ، عن طريق الطرد المركزي عند حوالي 850 × جم لمدة 5 دقائق.
- قم بتخفيف الببتيدات مرتين باستخدام 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت B (انظر الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت) وقم بتجميع الجزأين.
- قم بتجفيف الببتيدات الممسوحة في مكثف فراغ (انظر مواد الجدول والكواشف للحصول على التفاصيل). في هذه الأثناء ، قم بإعداد محلول الهضم الذي يتكون من 50 ملي مول من بيكربونات الأمونيوم المخففة من محلول مخزون 1 متر طازج (انظر الجدول 1).
- أضف التربسين أو LysargiNase إلى العينات المعنية ، إلى تركيز نهائي قدره 25 نانوغرام / ميكرولتر. احتضان كل عينة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- إضافة 1 ميكرولتر من 5 ٪ TFA لوقف الهضم. دوامة وتدور العينات.
ملاحظة: يمكن تثبيط الانقسام الأنزيمي بواسطة التربسين عند النهاية C ل R و K الميثيلين ، مما يتسبب في حدوث انشقاقات مفقودة تزيد من طول الببتيد وشحنته ، والتي بدورها تنتج أطياف تجزئة معقدة وغير كاملة تعوق تحديد الببتيد والإسناد الخاص بالموقع لمواقع المثيلة. وقد تبين أن الهضم الأنزيمي الثاني قد يقلل من تواتر مثل هذه الانقسامات الفائتة ، مع تحسين تغطية التسلسل وإسناد الموقع20.
10. تحلية الببتيدات (الوقت الإرشادي المطلوب 30 دقيقة)
- قم بتحميل محاليل الببتيد المحمضة إلى أعمدة C18-RP الدقيقة الجديدة التي تمت موازنتها مسبقا باتباع نفس الخطوات الموضحة في النقطة 8.
- يمكن تخزين الببتيد المحمل على الأعمدة الدقيقة C18-RP عند 4 درجات مئوية حتى يتم غسله لتحليل LC-MS / MS.
11. تحليل الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) (الوقت الإرشادي 5 أيام)
- قم بتخفيف الببتيدات من الأعمدة الدقيقة C18-RP عن طريق تمرير 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت B ، والطرد المركزي عند 615 × جم لمدة 5 دقائق عند RT. كرر هذه الخطوة مرتين وادمج الشحوم.
- قلل من حجم الشطف في مكثف الفراغ حتى يجف تقريبا ، وتجنب الإفراط في التجفيف.
- أعد تعليق الببتيدات في 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت A لتحليل LC-MS / MS.
- تحليل كل جزء من R-methyl-peptides بواسطة مطياف الكتلة الترادفية اللوني السائل (LC-MS / MS) في مطياف الكتلة عالي الدقة (انظر جدول المواد) ، مقترنا بنظام كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء (UHPLC) ذات تدفق نانوي. اضبط معلمات الأداة كما هو موضح في الجدول 2.
- قم بتحميل 2 ميكرولتر من كل عينة على عمود تحليلي نانوي (عمود رش سهل القطر الداخلي 75 ميكرومتر ، طول 25 سم) ، معبأ براتنج C18-RP (حجم جسيم 2 ميكرومتر).
- يتم تمرير العينات من خلال عمود النانو C18 RP بمعدل تدفق 300 nL / min ، مع التدرج الخطي التالي: 3٪ -30٪ B لمدة 89 دقيقة ، 30٪ -60٪ B لمدة 5 دقائق ، 60٪ -95٪ B لمدة 1 دقيقة ، و 95٪ B لمدة 5 دقائق.
- يعمل مطياف الكتلة في وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) للتبديل تلقائيا بين المسح الكامل MS واكتساب MS / MS. قم بتعيين المسح الكامل للمسح MS ليتم تحليله في كاشف مقياس الطيف بدقة R = 70000. يتم عزل أيونات الببتيد الخمسة عشر الأكثر كثافة بالتتابع إلى قيمة مستهدفة تبلغ 3 × 106 ومجزأة بطاقة تصادم نسبية تبلغ 28٪. اضبط الحد الأقصى المسموح به لأوقات تراكم الأيونات على 20 مللي ثانية للمسح الكامل و 50 مللي ثانية ل MS / MS وقم بإصلاح القيمة المستهدفة ل MSMS إلى 1 × 106. يتم تعيين وقت الاستبعاد الديناميكي على 20 ثانية.
12. تشغيل تحليل بيانات MaxQuant و hmSEEKER
- عند الانتهاء من تشغيل LC-MS / MS ، قم باستيراد البيانات الأولية MS إلى محرك بحث الببتيد لتحديد ببتيدات الميثيل من خلال النهج القائم على الاحتمالات مقابل قاعدة البيانات المرجعية. في هذا البروتوكول ، تم استخدام الإصدار 1.6.2.10 من MaxQuant لتحليلنا. يتطلب MaxQuant ما لا يقل عن 2 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي للتشغيل ، بالإضافة إلى مساحة قرص كافية لتخزين جميع البيانات الأولية وجميع ملفات الإخراج.
ملاحظة: راجع الوثائق الرسمية في https://www.maxquant.org للحصول على كافة التفاصيل حول التثبيت ومتطلبات الأجهزة والبرامج. - تكرار كل ملف بيانات أولي. أعد تسمية النسخ الأصلية عن طريق إلحاق "_light" بأسمائها ، ثم أعد تسمية النسخ عن طريق إلحاق "_heavy".
ملاحظة: hmSEEKER، البرنامج النصي لتحليل المصب ، حساس لحالة الأحرف. - قم بتشغيل بحث MaxQuant / Andromeda عن تحديد الببتيد مع الإعدادات المشار إليها في الجدول 3. من بين العديد من بيانات الإخراج التي تنتجها MaxQuant ، لا يلزم سوى جميع ملفات الببتيدات .txt و msms.txt (الموجودة في المجلد الفرعي المدمج / txt) لخطوة ما بعد المعالجة.
- يتم تنفيذ المعالجة اللاحقة لبيانات إخراج MaxQuant بواسطة الخوارزمية hmSEEKER. تحميل hmSEEKER من: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. يتوفر البرنامج النصي كدفتر ملاحظات Jupyter مكتوب بلغة Python 3.7 ويأتي مع مجموعة بيانات نموذجية لأغراض الاختبار. بالنسبة للمستخدمين الجدد ، ينصح بتنزيل وتثبيت منصة Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). يتضمن الإصدار الأخير افتراضيا Python 3.8 و Jupyter وجميع الحزم المطلوبة لتشغيل hmSEEKER (على سبيل المثال ، Scikit-learn 0.23.1).
- قم بإنشاء مجلد وتخزين الملفات allPeptides .txt و msms .txt من إخراج MaxQuant فيه.
- قم بتشغيل Jupyter (من سطر الأوامر أو من ملاح Anaconda).
- انتقل إلى مجلد hmSEEKER وافتح hmSEEKER.ipynb.
- في المقطع معلمات الإدخال من دفتر الملاحظات ، أشر إلى المسارات إلى قاعدة بيانات FASTA وإلى المجلد (المجلدات) التي تحتوي على ملفات MaxQuant النصية.
- قم بتشغيل الكود داخل كل خلية عن طريق تحديد الخلية والنقر فوق الزر "تشغيل " أعلى واجهة Jupyter.
- ينتج البرنامج النصي ملف إخراج مفصول بفواصل لكل مجموعة بيانات تم تحليلها ، بالإضافة إلى ملف مدمج. يمكن العثور على قائمة الزوجات النهائية في الملف المسمى "[التاريخ] - [الوقت] -combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
(يتضمن الجدول 4 وصفا موجزا للأعمدة في جدول الإخراج).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصف المقالة سير العمل لتحديد الثقة العالية لمثيلة البروتين العالمي R-methylation ، والذي يعتمد على مزيج من الهضم الأنزيمي لمستخلص البروتين مع اثنين من البروتياز المتميزين بالتوازي ، متبوعا بتجزئة كروماتوغرافيا HpH-RP السائلة للببتيدات المحللة للبروتين وإثراء التقارب المناعي لببتيدات R-methyl مع الأجسام المضادة المضادة لعموم R-methyl (الشكل 1).
نمت الخلايا في وجود الميثيونين ، إما طبيعي (خفيف ، L ، Met-0) أو موسوم نظائريا (ثقيل ، H ، Met-4). عند وضع العلامات النظيرية الكاملة ، والتي تم اختبارها بواسطة تحليل MS على حصة صغيرة من مستخلص Met-4 فقط ، تم حصاد الخلايا الثقيلة والخفيفة وخلطها بنسبة 1: 1 لتر / ساعة ، كما هو موضح في الشكل 1A. عند وضع العلامات الأيضية 13CD 3-methionine ، تتم إضافة مجموعات الميثيل إلى العمود الفقري للبروتين من S-adenosyl-methionine (SAM) المانح للميثيل وستكون موجودة إما في شكل النظيرالثقيل أو 21. يصف الشكل 1B تفاعل مثيلة الأرجينين الذي تقوم به عائلة بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMTs) التي تحفز نقل مجموعة الميثيل من S-adenosyl methionine (SAM) إلى نيتروجين جوانيدينو في أرجينين. إذا تم وضع مجموعة ميثيل واحدة على إحدى ذرات النيتروجين الطرفية للأرجينين ، يتم الحصول على أرجينين أحادي الميثيل (MMA). إذا تمت إضافة مجموعتي ميثيل على نفس ذرة النيتروجين في مجموعة جوانيدينو ، يتم إنشاء أرجينين ثنائي الميثيل غير متماثل (ADMA) ، بينما إذا تم وضع مجموعتي ميثيل على ذرتين مختلفتين من النيتروجين ، يتم إنتاج أرجينين ثنائي الميثيل المتماثل (SDMA).
بعد الخلط في الخلايا ذات العلامات الخفيفة والثقيلة بنسبة 1: 1 ، تم استخراج البروتينات وتعريضها للهضم بواسطة Trypsin و LysargiNase ، بالتوازي. كما هو موضح في الشكل 2 ، تم استخدام هلام SDS-PAGE Coomassie الملون للتحقق من الهضم الأنزيمي الفعال للبروتينات الكلية في الببتيدات (قارن الممرات الأولى والثانية). علاوة على ذلك ، تم تقييم كفاءة خطوة التنقية التي قام بها عمود C18 Sep-Pak ، مما يؤكد عدم وجود الببتيدات في تدفق العمود C18 (الشكل 2 ، الممر III) وفي الغسيل الأول والثاني (الشكل 2 الحارة IV و V ، على التوالي) ، مع وجودها المتوقع في الشطف (الشكل 2 ، الحارة السادسة). تم تقييم الدمج الصحيح ل Met-4 في القناة الثقيلة (الشكل 2B) والخلط الصحيح 1: 1 H / L (الشكل 2C).
يعرض الشكل 3 مخطط الكروماتوجرام من تجزئة كروماتوغرافيا HpH-RP السائلة خارج الخط للببتيدات والتسلسل اللاحق غير المتجاور للكسور. تم الكشف عن الببتيدات بواسطة 215 نانومتر من الأشعة فوق البنفسجية بينما تم تقييم البروتينات غير المهضومة التي يحتمل أن تكون متبقية بواسطة 280 نانومتر من الأشعة فوق البنفسجية. أسفل مخطط الكروماتوجرام ، يتم تخطيط استراتيجية تسلسل الكسور ، لتقليل 70 كسرا بداية إلى 16 النهائية ، بما في ذلك كسور التدرج PRE و POST.
تم استخدام الأجسام المضادة المضادة لعموم R-methyl لإثراء الببتيدات R-methyl. تتعرف هذه الأجسام المضادة على الأنواع الثلاثة من مثيلة R (MMA و SDMA و ADMA) وهي متاحة تجاريا بشكل مترافق مباشرة مع حبات الأغاروز (انظر مواد الجدول والكواشف للحصول على التفاصيل). يسرد الجدول 1 جميع المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.
بعد الاستحواذ ، تم تحليل كل بيانات خام MS مرتين باستخدام MaxQuant ، لتحديد مثيلات خفيفة وثقيلة في مجموعات بحث مختلفة ، مع الأساس المنطقي بأن ببتيدات الميثيل (الثقيلة والخفيفة) لن يتم تحديدها إلا في مجموعة محددة. يؤدي البحث عن مثيلات ثقيلة وخفيفة بشكل منفصل إلى تحسين التحليل عن طريق تقليل عدد التعديلات المتغيرة التي تم إدخالها وتقليل مخاطر الببتيدات المختلطة الإيجابية الكاذبة. بمجرد أن تقوم MaxQuant بتعيين مواقع الميثيل ، يقوم hmSEEKER بتحليل جدول الإخراج الخاص به لإعادة بناء أزواج محتملة من قمم الضوء الثقيل13.
يوضح الشكلان 4 و 5 أطياف MS الكاملة للببتيدات FELTGIPPAPR (me) (4) و NPPGFAFVEFEDPR (me) (5) ، والتي تمثل شرحا إيجابيا حقيقيا وإيجابيا خاطئا لميثيل ببتيد ، على التوالي. في الشكل 4 ، تتوافق الاختلافات m / z التي لوحظت بين القمم الثلاث مع وجود بقايا ميثلية إنزيمية (7.0082 Th بين غير المعدلة والميثيل الخفيف ؛ 2.0102 Th بين الأشكال الخفيفة والثقيلة من ميثيل الببتيد). يحتوي مضاعفة hmSILAC الناتجة على ME تبلغ 0.40 جزء في المليون ، و dRT تبلغ 0.00 دقيقة ، و LogRatio تبلغ -0.41 ؛ هذه القيم أقل من العتبات الافتراضية التي يستخدمها hmSEEKER للتمييز بين ثنائيات الصواب والخطأ ، والتي تم تقديرها سابقا على النحو التالي: | أنا | < 2 جزء في المليون ، | dRT | < 0.5 دقيقة، و | لوغاريتوري | < 1. في الحالة الثانية الموضحة في الشكل 5 ، ينحرف الفرق m / z الملاحظ بين الببتيد الخفيف الميثيل ونظيره الثقيل المفترض عن القيمة المتوقعة بمقدار 0.0312 Th (ME = -37.28 جزء في المليون). علاوة على ذلك ، يحتوي هذا المزدوج على LogRatio يبلغ 2.50 ، وهو خارج الفاصل الزمني الافتراضي لتنبؤ LogRatio (تم تحديد قيم القطع هذه ومناقشتها في13). في الواقع ، في طيف MS / MS ، لم ينتج عن تسلسل الببتيد NPPGFAFVEFEDPR (me) تغطية كاملة ويمكن تفسير مثيلة R المخصصة أيضا على أنها أسترة ميثيل على الغلوتامات أو الأسبارتات بالقرب من R.
تم تخطيط سير عمل hmSEEKER في الشكل 6 ، بينما يقدم الجدول 4 وصفا لجدول الإخراج الذي تنتجه هذه الأداة ، للمساعدة في تفسير النتائج: تظهر الببتيدات التي تحمل تعديلات متعددة عدة مرات ، كل إدخال يتوافق مع حدث مثيلة مختلف على ببتيد معين. أخيرا ، تنقسم ثنائيات الذروة إلى ثلاث فئات: الزوجي المتطابقة هو الأكثر ثقة ، حيث تم تجزئة الببتيد وتحديده في كل من الشكل الثقيل والخفيف.
الشكل 1: مخطط سير العمل التجريبي وتفاعلات مثيلة البروتين الأنزيمي. (أ) مخطط سير العمل للبروتوكول الكيميائي الحيوي. تزرع الخلايا في الضوء (Met-0) والثقيلة (Met-4) الميثيونين التي تحتوي على وسط لمدة 8 مضاعفات على الأقل ويتم خلط القنوات الخفيفة والثقيلة بنسبة 1: 1. يتم استخراج البروتينات وتعريضها للهضم باستخدام التربسين أو LysargiNase بالتوازي وتجزئتها بواسطة كروماتوغرافيا HpH-RP السائلة خارج الخط عن طريق جمع 70 جزءا ، يتم دمجها أخيرا في 16 جزءا. يتم إثراء R-methyl-peptides بواسطة الأجسام المضادة المضادة لعموم R-methyl المترافقة مع حبات الأغاروز ، والتي خضعت لعملية الهضم الأنزيمي الثانية (Trypsin أو LysargiNase ، على التوالي) ، ويتم تحليلها بواسطة LC-MS / MS. تتم معالجة بيانات MS الخام بواسطة خوارزمية MaxQuant لتحديد الببتيد و PTM. ثم يتم تقديم بيانات مخرجات MaxQuant للتحليل بواسطة أداة المعلوماتية الحيوية hmSEEKER ، التي تم تطويرها داخليا لجمعية ميثيل الببتيد الثقيلة والخفيفة. (ب) مخطط تفاعل R-methylation. يمكن تعديل مجموعة Guanidino من الأرجينين عن طريق إضافة مجموعة ميثيل واحدة ، وإنتاج أرجينين أحادي الميثيل (MMA) أو عن طريق إضافة مجموعتي ميثيل ، مما ينتج إما متماثل (SDMA) أو غير متماثل (ADMA) ثنائي الميثيل أرجينين. يتم تحفيز التفاعل بواسطة إنزيمات من عائلة بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMTs) ، التي تنقل مجموعات الميثيل هذه من S-Adenosyl-Methionine (SAM). بعد نقل مجموعة الميثيل ، يتم تقليل SAM إلى S-adenosylhomocysteine (SAH). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: ضوابط الخطوات الحرجة للبروتوكول. (أ) SDS-PAGE جل ملطخ ب Coomassie لتقييم كفاءة الهضم المحللة للبروتين. MW: علامات الوزن الجزيئي. I) 20 ميكروغرام من إجمالي مستخلص البروتين H / L قبل الهضم المحدد بواسطة BCA ؛ II) الببتيدات المهضومة المحملة بنفس النسبة كما في I ؛ III) التدفق عبر خرطوشة C18 المحملة بنفس نسبة المسار I ؛ IV-V) الغسيل الأول والثاني لخرطوشة C18 مع المخزن المؤقت A ، محملة بنفس نسبة I ؛ VI) يشطف من خرطوشة C18 ، محملة بنفس نسبة I. (B) تحليل معدل الدمج Met-4. يتم تقييم دمج Met-4 في القناة الثقيلة من خلال برنامج نصي مطور داخليا (متوفر في https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/) ؛ المعدل = 1 يشير إلى الدمج الكامل (C) التوزيع الغاوسي لنسب H / L لتقييم الخلط 1: 1. يتم رسم التوزيع الطبيعي لنسبة Log2 H / L مع الأخذ في الاعتبار ±2σ. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مخطط تسلسل كسور HpH وتقييم إثراء الببتيدات الممثلة R-methylated . (أ) كروماتوجرام تجزئة الطور العكسي بدرجة الحموضة العالية ومخطط تسلسل الكسر غير المتجاورة. يمثل مخطط الكروماتوجرام ملف فصل HpH-RP للببتيدات المكتشفة عند 215 نانومتر من الأشعة فوق البنفسجية (الخط الأزرق) ، بينما تم تتبع وجود البروتينات غير المهضومة في قناة الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر (الخط الأحمر). يمثل الخط الأخضر الفاتح تركيز المخزن المؤقت B على طول المسار الكروماتوغرافي. تم الإبلاغ عن مخطط تجميع الكسور ، الذي يصور استراتيجية التسلسل غير المتجاور للكسور المبكرة والمتوسطة والمتأخرة ، من 70 إلى 16 ، بما في ذلك كسور PRE و POST المتدرجة. (ب) جدول تمثيلي يلخص إثراء الببتيدات R-methylated. يلخص الجدول العدد الإجمالي للببتيدات والنسبة المئوية النسبية لإثراء R-methylation مقارنة كل IP على مدخلاته. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: مثال على مضاعفة hmSILAC الحقيقية. الطيف الكتلي لمضاعفة إيجابية حقيقية. تتوافق القمم المعروضة مع الببتيد FELTGIPPAPR في الأشكال غير المعدلة ، أحادية الميثيل الخفيفة (CH 3) وأحادية الميثيل الثقيلة (13CD3) ، مع الشحنة 2+. تتوافق الاختلافات m / z التي لوحظت بين القمم الثلاث مع وجود بقايا ميثلية إنزيمية. يمثل الجدول الموجود أسفل الطيف الكتلي إخراج hmSEEKER ويحتوي على معلمات LogRatio و ME و dRT للمزدوج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: مثال على مضاعفة hmSILAC الكاذبة. الطيف الكتلي لتعيين سلبي في الجسم الحي ميثيل الببتيد. تتوافق القمم عند 811.3849 م / ز و 818.3927 م / ز مع الأشكال أحادية الميثيل غير المعدلة والخفيفة من الببتيد NPPGFAFVEFEDPR ، مع الشحنة 2+. يمكن تعيين الذروة الثالثة كنظير ثقيل ميثيل للببتيد الميثيلي الخفيف ، لكن التحول المرصود m / z يختلف عن التحول المتوقع بمقدار 0.0312 Th ، مما يستبعد هذا الاحتمال. يمثل الجدول الموجود أسفل الطيف الكتلي إخراج hmSEEKER ويحتوي على معلمات LogRatio و ME و dRT للمزدوج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: التمثيل التخطيطي لسير عمل تحليل البيانات. (أ) يكتشف MaxQuant قمم MS1 في البيانات الأولية. (ب) تتم معالجة القمم ذات طيف MS2 المرتبط بواسطة محرك بحث قاعدة البيانات Andromeda للحصول على تحديد الببتيد. (C) يقرأ hmSEEKER تحديدات الببتيد MaxQuant ويستخرج ببتيدات الميثيل مع درجة أندروميدا > 25 ، ودرجة دلتا > 12 ، والتعديلات مع احتمال التوطين > 0.75. (د) لكل ميثيل ببتيد يجتاز ترشيح الجودة ، يجد hmSEEKER ذروة MS1 المقابلة له في جدول MaxQuant allPeptides ثم يبحث عن نظيره في نفس الجدول. (ه) يتم تعريف مضاعفة القمم من خلال الفرق في وقت الاحتفاظ بها (RT) ، ونسبة شدتها (LogRatio) ، والانحراف بين كتلة دلتا المتوقعة والمرصودة (ME) ؛ يتم استخدام هذه المعلمات الثلاثة بواسطة hmSEEKER لتمييز الإيجابيات الحقيقية من الإيجابيات الخاطئة ، كما تمت مناقشته13. (و) وأخيرا، تصدر hmSEEKER قوائم بالبيانات المزدوجة الزائدة وغير الزائدة؛ يتضمن الأول تنبؤات لجميع ببتيدات الميثيل ، بينما يتم ترشيح الثاني بحيث عندما يتم تحديد الببتيد عدة مرات ، يتم الإبلاغ فقط عن أفضل نقاط مزدوجة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| مخزن مؤقت | حجم | تكوين |
| محلول ل-ميثيونين (L) | 10 مل | 30 ملغ / مل ميثيونين خفيف في ماء عالي النقاء |
| محلول ل-ميثيونين (H) | 10 مل | 30 ملغ / مل ميثيونين ثقيل في ماء عالي النقاء |
| متوسطة لزراعة الخلايا | 500 مل | DMEM مع الجلوتامين المستقر وبدون ميثيونين ، 10٪ (v / v) غسيل الكلى FBS ، 1٪ (v / v) P / S ، 1: 1000 (v / v) محلول L-methionine |
| تحلل العازلة | 50 مل | 9M اليوريا ، 20mM HEPES درجة الحموضة 8.0 ؛ 1 ٪ (v / v) مثبطات الأنزيم البروتيني ؛ 1٪ (v / v) مثبط الفوسفاتيز في الماء عالي النقاء |
| محلول بيكربونات الأمونيوم (AMBIC) | 50 مل | 1M (NH4) 2CO3 في الماء عالي النقاء |
| حل DTT | 10 مل | 1.25M DTT في ماء عالي النقاء |
| حل IAA | 5 مل | 109mM في الماء عالي النقاء |
| المذيب أ ل Sep-Pak C18 | 50 مل | 0.1٪ TFA في الماء عالي النقاء |
| المذيب B ل Sep-Pak C18 | 50 مل | 0.1٪ TFA + 40٪ ACN في الماء عالي النقاء |
| حل الغسيل ل Sep-Pak C18 | 50 مل | 0.1٪ TFA + 5٪ ACN في الماء عالي النقاء |
| المخزن المؤقت أ لتجزئة HpH | 500 مل | 25 مللي متر NH4OH في ماء عالي النقاء |
| المخزن المؤقت B لتجزئة HpH | 500 مل | 25 مللي متر NH4OH + 90٪ ACN في ماء فائق النقاء |
| المخزن المؤقت ربط IP 1x | 5 مل | Diluite 1:10 (V / V) في ماء عالي النقاء من 10x يتوفر محلول مخزون تجاري |
| المخزن المؤقت لشطف IP | 50 مل | 0.15٪ TFA في ماء عالي النقاء |
| المخزن المؤقت أ لنصائح المرحلة | 50 مل | 0.1٪ TFA في الماء عالي النقاء |
| المخزن المؤقت ب لنصائح المرحلة | 50 مل | 0.1٪ TFA + 40٪ ACN في الماء عالي النقاء |
| المخزن المؤقت C لنصائح المرحلة | 50 مل | 0.1٪ TFA + 50٪ ACN في الماء عالي النقاء |
| MS المذيب أ | 250 مل | 0.1٪ FA في الماء عالي النقاء |
| MS المذيب B | 250 مل | 0.1٪ FA + 80٪ ACN في الماء عالي النقاء |
| كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني | 5 مل | cOmplete ، أقراص مثبطات الأنزيم البروتيني الخالية من EDTA (ROCHE) المذابة في ماء عالي النقاء وفقا لتعليمات التصنيع |
| كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز | 5 مل | أقراص PhosSTOP (ROCHE) المذابة في ماء عالي النقاء وفقا لتعليمات التصنيع |
الجدول 1: المخازن المؤقتة وتكوين الحلول. قوائم المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.
| البارامترات | قيمة |
| تحميل العينة (uL) | 2 |
| معدل تدفق التحميل (uL / دقيقة) | 10 |
| معدل تدفق التدرج (nL / دقيقة) | 300 |
| التدرج الخطي | 3-30٪ B لمدة 89 دقيقة ، 30-60٪ B لمدة 5 دقائق ، 60-95٪ B لمدة 1 دقيقة ، 95٪ B لمدة 5 دقائق |
| دقة المسح الكامل | 70,000 |
| عدد الأيونات الأكثر كثافة المختارة | 15 |
| طاقة التصادم النسبية (٪) (CID) | 28 |
| الاستبعاد الديناميكي (الاستثناءات) | 20.0 |
الجدول 2: إعداد LC-MS/MS. المعلمات المطبقة لتحليل LC-MS / MS لببتيدات R-methyl-على مطياف الكتلة Quadrupole-Orbitrap عالي الدقة ، مقترنا بنظام كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء (UHPLC) ذات تدفق نانوي.
| إعدادات معلمات MQ (الإصدار 1.6.2.10) | |||
| اعداد | فعل | ||
| تكوين | |||
| التعديلات | ميته 4 | إضافة تعديل جديد. اضبط التركيب على H (-3) Hx (3) Cx C (-1) واختر M كخصوصية. | |
| ميثيل 4 (KR) | تكرار "Methyl (KR)" ، وإعادة تسميته وتغيير التكوين إلى Cx H (-1) Hx (3) | ||
| ثنائي ميثيل 4 (KR) | كرر "ثنائي ميثيل (KR)" ، أعد تسميته وقم بتغيير التكوين إلى H (-2) Hx (6) Cx (2) | ||
| تريميثيل4 (ك) | تكرار "Trimethyl (K)" ، وإعادة تسميته وتغيير التكوين إلى Cx (3) H (-3) Hx (9) | ||
| أوكسميت4 | تكرار "الأكسدة (M)" وإعادة تسميته. | ||
| البروتياز | ليسارجيناز | أضف بروتياز جديد. حدد العمودين "R" و "K". | |
| عند إنشاء PTM أو بروتياز جديد ، انقر فوق "تعديل الجدول" لتغيير إعدادات MaxQuant ثم "حفظ التغييرات" لتأكيد التغييرات. أعد تشغيل MaxQuant وستكون الخيارات الجديدة مرئية. | |||
| علامة التبويب "الملفات الأولية" | |||
| مجموعة المعلمات | افصل الملفات الأولية إلى مجموعتين (0 و 1) | ||
| معلمات المجموعة الخاصة | |||
| نوع | نوع | معيار | |
| تعدد | 1 | ||
| هضم | انزيم | التربسين أو ليسارجيناز | |
| الأعلى.الانقسامات الفائتة | اضبط على 3 | ||
| التعديلات | تعديلات متغيرة | المجموعة 0 | الأكسدة (م) ، الميثيل (KR) ، ثنائي ميثيل (KR) ، ثلاثي ميثيل (K) |
| المجموعة 1 | أوكسميت 4 ، ميثيل 4 (KR) ، ثنائي ميثيل 4 (KR) ، ثلاثي ميثيل 4 (ك) | ||
| التعديلات الثابتة | المجموعة 0 | كارباميدوميثيل | |
| المجموعة 1 | كارباميدوميثيل وميت4 | ||
| المعلمات العالمية | |||
| تسلسل | ملفات فاستا | تحميل ملف فاستا | |
| تعريف | بي إس إم روزفلت | اضبط على 0.01 | |
| الحد الأدنى لنقاط الببتيدات المعدلة | اضبط على 1 | ||
| الحد الأدنى لدرجة دلتا للببتيدات المعدلة | اضبط على 1 | ||
| تحديد متقدم | البحث الثاني عن الببتيد | تحقق من | |
| المناضد | اكتب الكلجدول الببتيدات | فحص | |
| متقدم | حساب خصائص الذروة | فحص | |
| إذا لم يتم تحديدها، فاترك المعلمة الافتراضية. | |||
| إعدادات معلمات MQ لاختبار التأسيس | |||
| معلمات المجموعة الخاصة | |||
| نوع | نوع | معيار | |
| تعدد | 2 | ||
| ماكس المسمى | 5 | ||
| التسمية الثقيلة | حدد Met4 | ||
| هضم | انزيم | التربسين أو ليسارجيناز | |
| الأعلى.الانقسامات الفائتة | اضبط على 3 | ||
| التعديلات | تعديلات متغيرة | الأكسدة (م) | |
| التعديلات الثابتة | كارباميدوميثيل | ||
| إذا لم يتم تحديدها، فاترك المعلمة الافتراضية. | |||
الجدول 3: معلمات معالجة MaxQuant. يتم سرد المعلمات الخاصة بالمجموعة والمعلمات العامة المعدلة وفقا للتجربة المحددة الموضحة. تم تعيين جميع المعلمات الأخرى كإعداد افتراضي ، اعتمادا على إصدار البرنامج المستخدم.
| اسم العمود | وصف |
| راوفيل | ملف البيانات الأولية الذي تم فيه تحديد الازدواج |
| H-Scan | رقم المسح الضوئي للنظير الثقيل |
| L-المسح الضوئي | مسح رقم نظير الضوء |
| .CLASS | يمكن أن يكون لها 3 قيم: |
| متطابق = يتم تحديد الببتيدات الثقيلة والخفيفة بنفس التسلسل | |
| غير متطابق = الببتيدات الثقيلة والخفيفة لها نفس تسلسل aa ولكن هناك عدم تطابق في توطين الموقع الميثيلي | |
| تم إنقاذه = يتم تحديد ببتيد واحد فقط في المضاعفة ؛ نظيره هو ذروة مجهولة الهوية. | |
| الببتيد | تسلسل الببتيد |
| نقاط | الببتيد أندروميدا النتيجة |
| القرار | بقايا معدلة |
| نقاط البيع | موقف البقايا المعدلة |
| وزاره الدفاع | تعديل |
| بروتين الرصاص | البروتين الذي ينتمي إليه الببتيد |
| الجين | اسم الجين المقابل للبروتين |
| PROBABILITY_TRUE | احتمال أن يكون الازدواج هو مزدوج hmSILAC حقيقي ، محسوبا بواسطة نموذج الانحدار اللوجستي |
| التنبؤ | 1 إذا كان المزدوج صحيحا مفترضا ، 0 إذا كان خطأ |
| H / L لوغاريتمية | Log2 لنسبة الكثافة الثقيلة / الخفيفة |
| أنا | الانحراف بين فرق الكتلة المتوقع والملاحظ |
| DRT | الفرق في وقت الاحتفاظ |
الجدول 4: وصف نتائج مخرجات hmSEEKER. قائمة بإدخالات الأعمدة في جدول إخراج hmSEEKER، مع وصف موجز لمحتواها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمثل تحديد الثقة العالية لمثيلة البروتين / الببتيد في الجسم الحي بواسطة البروتينات العالمية القائمة على مرض التصلب العصبي المتعدد أمرا صعبا ، بسبب خطر ارتفاع FDR ، مع حدوث العديد من بدائل الأحماض الأمينية وأسترة الميثيل أثناء تحضير العينة التي تكون متساوية الضغط للمثيلة ويمكن أن تسبب تعيينات خاطئة في غياب استراتيجيات التحقق من MS المتعامدة. وتزيد الطبيعة الارتدادية لهذه الآلية من تعقيد مهمة بروتينات الميثيل العالمية، ولكن يمكن التغلب عليها بالإثراء الانتقائي للببتيدات المعدلة10.
هنا ، يتم تقديم سير عمل كيميائي حيوي وتحليلي ، والذي تم تصميمه لزيادة كفاءة وموثوقية تحليل MS العالمي لببتيدات R-methyl-peptides من خلال تطبيق استراتيجية hmSILAC المقترنة بتجزئة الببتيد اللوني HpH-RP وإثراء التقارب مع مجموعات الأجسام المضادة للببتيدات المضادة ل Pan-R-methyl-peptides. تسمح الاستراتيجية الأولى بالتحقق المتعامد من ببتيدات الميثيل وتقلل بشدة من FDR لتحديد الهوية ، بينما يزيد البروتوكول الأخير من إمكانية اكتشافها من خلفية الببتيدات غير المعدلة22. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذا البروتوكول هو متطلبات كمية كبيرة جدا من مستخلص البروتين الأولي (في حدود 20-40 مجم) كمدخل لتجزئة الببتيد اللاحقة وإثراء التقارب ، مما يحد من تطبيق الطريقة على خطوط الخلايا الخالدة سريعة النمو والتي يمكن توسيعها على نطاق واسع. بدلا من ذلك ، لا ينطبق الإعداد الحالي على الخلايا أو الأنسجة الأولية المشتقة من المريض. يجب توجيه التحقيقات المستقبلية لتحسين البروتوكول في هذا الاتجاه: يمكن أن تسمح الاستراتيجيات الإضافية للتخصيب الكيميائي الحيوي للببتيد الميثيلي على الببتيد غير المعدل بالتحايل على استخدام الأجسام المضادة ، مما يتيح تقليص التجارب. ويمكن تمثيل تطور آخر مثير للاهتمام بالجمع بين الأساليب الحالية والتعديل الكيميائي للببتيدات المحللة للبروتين مع علامات الكتلة متساوية الضغط أو الترادفية، مع مزايا محتملة ذات شقين: من ناحية، إمكانية الجمع بين شروط متعددة في تجربة واحدة، وبالتالي مضاعفة القياس الكمي النسبي للتغيرات في بروتينات الميثيل عند حدوث اضطرابات مختلفة؛ ومن ناحية أخرى، إمكانية الجمع بين ظروف متعددة في تجربة واحدة، وبالتالي مضاعفة القياس الكمي النسبي للتغيرات في بروتينات الميثيل عند حدوث اضطرابات مختلفة؛ ومن ناحية أخرى، إمكانية الجمع بين ظروف متعددة في تجربة واحدة، وبالتالي مضاعفة القياس الكمي النسبي للتغيرات في بروتينات الميثيل - البروتينية عند حدوث اضطرابات مختلفة؛ ومن ناحية أخرى، إمكانية الجمع بين ظروف متعددة في تجربة واحدة، ومن ناحية أخرى، إمكانية الجمع بين ظروف متعددة في تجربة واحدة، وبالتالي مضاعفة القياس الكمي النسبي للتغيرات في بروتينات الميثيل عند حدوث اضطرابات مختلفة؛ ومن ناحية أخرى، إمكانية الجمع بين ظروف متعددة في تجربة واحدة، ومن ناحية أخرى، إمكانية الجمع بين الببتيدات المحللة للبروتينات من ناحية أخرى ، قد يسمح تجميع عينات مختلفة في عينة واحدة قبل التجزئة الكروماتوغرافية وإثراء التقارب بتقليل حجم التجارب الفردية.
يعتمد هذا البروتوكول على هضمين منفصلين لمستخلص الخلية بالكامل بالتوازي مع Trypsin و LysargiNase. يشق التربسين رابطة الببتيد في الجانب الطرفي C من بقايا K و R ، مما يولد الببتيدات التي تقدم بقايا موجبة الشحنة في المحطة C ، بالإضافة إلى الشحنة الموجبة N-terminal من α-amine23. يتحلل إنزيم LysargiNase بشكل انتقائي روابط الببتيديل-K و -R ، مما يولد الببتيدات التي تحمل K أو R في موقع N-terminal ، والتي يمكن أن تشمل أشكال K-methylated. يزيد استخدام كل من البروتياز من التغطية الكلية للبروتين في تحليل MS على نطاق واسع ، مما يؤدي إلى تحديد الببتيدات التي فاتتها في النهاية عملية هضم واحدة18. بدلا من ذلك ، يتم إجراء الهضم الأنزيمي المزدوج لتقليل عدد الانقسامات الأنزيمية المفقودة المحتملة. في الواقع ، تقلل مثيلة K و R بشدة من كفاءة انقسام البروتين بواسطة التربسين. على الرغم من هذا الاحتياط ، لا يزال من الشائع أن تكون الببتيدات الميثيلية أطول وتحتوي على انقسامات مفقودة ، مما يؤدي إلى ضعف تجزئة CID.
يمكن أن يؤدي استخدام نوع آخر من التجزئة ، مثل تفكك نقل الإلكترون (ETD) ، إلى حل هذه المشكلة. في الواقع ، لا يقوم ETD عادة بتجزئة أيونات الببتيد ذات الشحنة المزدوجة بكفاءة كما يفعل CID ، ولكنه يوفر انشقاقا موحدا إلى حد ما لسلائف الببتيد لحالات الشحن الأعلى (≥3). قد يكون هذا ميزة في حالة R-methylation ، لأنه يحدث بشكل متكرر في المجالات الغنية بالأرجينين التي تحتوي على بقايا R متعددة ومجاورة. ومع ذلك ، فإن ETD لديها معدل مسح أقل من CID ، وبالتالي يتم تقليل العدد الإجمالي لتحديدات الببتيد24،25،26.
في الآونة الأخيرة ، اقترنت العديد من البروتوكولات التي تنطوي على إثراء الببتيدات المعدلة بعد الترجمة باستراتيجيات فصل كروماتوغرافيا مختلفة تساعد على تقليل تعقيد خليط الببتيد ، وبالتالي زيادة الكفاءة الإجمالية للكشف عن الببتيدات المعدلة في مرض التصلب العصبي المتعدد. هنا ، يتم تطبيق التجزئة الكروماتوغرافية HpH-RP إلى جانب التسلسل غير المتجاور للكسور. تعرض تجزئة الببتيد خارج الخط بناء على كروماتوغرافيا الطور العكسي ذات الأس الهيدروجيني العالي فصلا عاليا للقدرة على الحل يكون متعامدا مع فصل RP منخفض الأس الهيدروجيني عبر الإنترنت الذي يتم تنفيذه في اتجاه مجرى النهر أثناء تشغيل LC-MS / MS27. علاوة على ذلك ، فإن استراتيجية التسلسل غير المتجاورة لها ميزتان رئيسيتان: أولا ، تزيد من تغطية البروتين عن طريق تجميع الكسور المبكرة والمتوسطة والمتأخرة في أجزاء متسلسلة فردية ، مما يحافظ على عدم تجانس خليط الببتيد. ثانيا ، يقلل التسلسل من تحليل وقت تشغيل MS اللاحق ، من خلال الحصول على عدد أقل من كسور العينة28.
نظرا للطبيعة التكميلية لمثيلة R ، فإن خطوة التخصيب ضرورية لتسهيل الكشف عن ببتيدات الميثيل في تحليل MS العالمي لبروتينات التعديل. في هذا البروتوكول ، يتم إثراء ببتيدات الميثيل عن طريق ترسيب التقارب المناعي (IAP) باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل SDMA ومضادات ADMA بالتوازي ، بينما يتم إجراء الترسيب المناعي للببتيدات أحادية الميثيل باستخدام الأجسام المضادة ل MMA على FTs من تجارب IAP السابقة. يعكس هذا الترتيب الكفاءة المختلفة لهذه الأجسام المضادة: الأجسام المضادة ل SDMA والأجسام المضادة ل ADMA لها كفاءة ربط أقل مقارنة بالأجسام المضادة ل MMA. تجدر الإشارة إلى أن هذه الكفاءة المختلفة قد تسبب أيضا تحيزات في تمثيل الدرجات المختلفة لمثيلات R في البروتينات المعدلة المشروحة تجريبيا29.
قبل التوافر التجاري للأجسام المضادة المضادة لمثيلة عموم R ، تم تطبيق استراتيجيات فصل أخرى لتعزيز اكتشاف الببتيد R-methylated بواسطة MS ، مثل التبادل الكاتيوني القوي (SCX) وكروماتوغرافيا التفاعل المحب للماء (HILIC). على الرغم من أن هذه التقنيات يمكن أن تقلل من تعقيد خليط الببتيد الذي تم تحليله في مرض التصلب العصبي المتعدد ، إلا أنها لم تحسن بشكل كبير من تحديد ببتيدات الميثيل30،31،32،33.
على الرغم من كل هذه الحلول التقنية والتحليلية التي تهدف إلى زيادة فصل ببتيد الميثيل والكشف والتجزئة والتعليق التوضيحي للتسلسل ، لا تزال تغطية ميثيل البروتين محدودة ومنحازة نحو البروتينات المثيلية الأكثر وفرة ، مثل البروتين النووي الريبي ، الحلزونات المرتبطة بالحمض النووي الريبي ، في حين أن العديد من البروتينات المعدلة منخفضة الوفرة المعروفة (على سبيل المثال ، TP53BP1 ، CHTF8 ، MCM2) يتم اكتشافها فقط بالصدفة وليس بشكل موثوق عبر تجارب عالمية متعددة34 . ويمكن أن يؤدي التقسيم دون الخلوي المطبق قبل سير العمل الحالي إلى تحسين الكشف عن هذه البروتينات؛ ومع ذلك ، فإن النطاق التجريبي الحالي المطلوب لا يجعل هذا بديلا قابلا للتطبيق.
عند MS ، يتم تحليل البيانات الأولية من خلال خوارزمية MaxQuant لتحديد الببتيد و PTM. ومع ذلك ، فإن تحليل البيانات من تجارب hmSILAC ليس مباشرا مع خوارزميات البحث القياسية. على سبيل المثال ، في حين أن MaxQuant يمكنها تحليل تجارب SILAC القياسية بكفاءة بناء على وضع العلامات الأيضية باستخدام K و R المشفرين نظائريا ، إلا أنها لا تعمل بكفاءة عندما يتم ترميز وضع العلامات على النظائر في PTM متغير ، كما في حالة وضع العلامات على الميثيل الثقيل الذي يؤدي إلى مثيلة ثقيلة. لذلك ، تتمثل الاستراتيجية المعتمدة هنا في تحليل بيانات hmSILAC أولا باستخدام MaxQuant دون استخدام وظيفة البحث المزدوج المدمجة بحيث يمكن تحديد الببتيدات الخفيفة والثقيلة بشكل مستقل ؛ ثم يتم مطابقتها مع برنامج ما بعد المعالجة. يحتوي سير العمل المعلوماتي الحيوي هذا أيضا على عيوبه الخاصة ، حيث يتعين على المرء تحديد مثيلات في كل من الأشكال الثقيلة والخفيفة في لوحة التعديلات المتغيرة في MaxQuant ، وينتهي الأمر بما مجموعه ثمانية تعديلات متغيرة عند تضمين أكسدة الميثيونين (الثقيلة والخفيفة) أيضا. يعد البحث عن عدد كبير جدا من PTMs باستخدام محرك بحث قاعدة بيانات مثل MaxQuant / Andromeda أمرا غير عملي ، لأنه يؤدي إلى زيادة هائلة في الببتيدات النظرية التي يتعين على الخوارزمية اختبارها: كان حلنا هو تحليل كل بيانات MS الخام مرتين ، مع مجموعات مختلفة من PTMs المتغيرة (من خلال وظيفة مجموعات المعلمات في MaxQuant). بعد البحث عن الببتيد ، يتم استخدام الأداة المطورة داخليا hmSEEKER لدعم تخصيص أزواج الببتيد الخفيفة الثقيلة من جداول الإخراج التي تنتجها MaxQuant. تم نشر الإصدار الأول من خوارزمية hmSEEKER مؤخرا13 ، حيث تبين أن hmSEEKER يمكنه تحديد مضاعفات hmSILAC مع FDR < 1٪. لا يزال من الممكن أن تنشأ الإيجابيات الكاذبة من أزواج القمم التي يكون لها بالصدفة مضاعف فرق كتلة يبلغ 4.02 Da ، ولكن هذا غير مرجح جدا بالنسبة للثنائيات المصنفة على أنها متطابقة أو غير متطابقة ، في ضوء الحقائق التالية: لكي يكون الثنائي المطابق أو غير المطابق خاطئا ، يتعين على أندروميدا تحديد تسلسل كل من النظير الثقيل والخفيف بشكل غير صحيح. بافتراض أن محرك البحث قد تم تشغيله بمعلماته الافتراضية ، فإن كل تعريف لديه احتمال 1٪ لكونه غير صحيح. وبالتالي ، فإن احتمال أن يكون نظير hmSILAC غير صحيح أيضا هو 0.01٪.
أحد مزالق hmSILAC هو أن الببتيدات التي تحتوي على الميثيونين في عمودها الفقري تولد أيضا ثنائيات لا يمكن تمييزها عن تلك الناتجة عن ببتيدات الميثيل. ومع ذلك ، من تجربتنا ، لا ينبغي أن يمثل هذا مشكلة رئيسية ، أولا لأن الببتيدات بدون مثيلات يمكن التخلص منها ببساطة من ناتج MaxQuant ، وثانيا ، لأن hmSEEKER يأخذ تلقائيا في الاعتبار أي بقايا ميثيونين في ببتيد الميثيل عند حساب فرق الكتلة المتوقع ؛ أخيرا ، يتم استبعاد هذا الخطر أيضا من خلال حقيقة أنه يتم البحث عن التعديلات الثقيلة والخفيفة في مجموعات معلمات منفصلة ، بحيث لا يمكن لمحرك البحث تقسيم أحادي المثيلة الثقيلة (+18.03 Da) إلى أحادي المثيلة الخفيفة بالإضافة إلى الميثيونين الثقيل (14.01 + 4.02 Da).
تم اقتراح حل أكثر رسمية وتجريبية لهذه المشكلة من قبل Oreste Acuto ومعاونيه ، الذين طوروا نوعا مختلفا من hmSILAC ، يسمى isomethionine methyl-SILAC (iMethyl-SILAC)22. في بروتوكول وضع العلامات الأيضية البديل هذا ، يتم استبدال الميثيونين بالضوء الطبيعي [13 C 4] -Methionine ، الذي له نفس كتلة [13CD3] -Methionine (Met-4) ، ومع ذلك فهو لا ينتج مجموعات ميثيل مستقرة مشفرة بالنظائر ، بسبب التوزيع المختلف للنظائر الثقيلة داخل العلامة الجزيئية. وهكذا ، في تجارب iMethyl-SILAC ، لا تولد الببتيدات المحتوية على الميثيونين غير المعدلة ثنائيات. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه عندما قارن Acuto وزملاؤه أداء iMethyl-SILAC و hmSILAC التقليدي ، لا تزال الطريقتان تعرضان FDRs متشابهة جدا.
أحد القيود المحتملة على hmSEEKER هو أنه مصمم للعمل مباشرة على جداول إخراج MaxQuant بحيث لا تتوافق شفرة المصدر الخاصة به مع محركات البحث الأخرى ، التي يتم تنظيم ملفات الإخراج الخاصة بها بشكل مختلف ؛ وبهذا المعنى ، يوفر MethylQuant35 أداة معلوماتية حيوية بديلة جيدة مصممة خصيصا للتحليل المباشر للبيانات الأولية MS من نوع hmSILAC من التجارب وأكثر مرونة من حيث ملفات الإدخال المقدمة. نموذج التعلم الآلي قيد التطوير من أجل التمييز بين مضاعفة ميثيل الببتيد H / L الحقيقية والخاطئة دون الاعتماد على العتبات المحددة من قبل المستخدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
MM و EM هم طلاب دكتوراه في المدرسة الأوروبية للطب الجزيئي (SEMM). EM هو المستفيد من منحة FIRC-AIRC لمدة 3 سنوات (رمز المشروع: 22506). يتم دعم التحليلات العالمية لبروتينات R-methyl-في مجموعة السل من قبل AIRC IG Grant (رمز المشروع: 21834).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al.
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
